El siguiente método está adaptado para probar cepas competidoras con cepas productoras de inhibidores.
NOTA: Este protocolo implica la generación de aerosoles con cultivos bacterianos. Esto solo se puede realizar en un espacio confinado con la implementación de consideraciones de seguridad aprobadas localmente. La pulverización del cultivo en las placas de agar dentro de una cabina de seguridad de nivel 2 minimizará la contaminación de las placas de agar y el entorno circundante. Esto también protegerá al investigador de la inhalación de aerosoles de las bacterias rociadas, esta es una preocupación importante si el investigador está utilizando organismos de nivel de contención 2. Se debe usar equipo de protección personal adecuado. El área que rodea la placa de Petri se cubre mejor con tejido absorbente desechable. Se aconseja la descontaminación posterior a la pulverización con luz ultravioleta.
1. Preparando las placas de agar
- Prepare el agar de infusión cerebro-corazón (BHI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Esterilizar el agar BHI en autoclave a 121 °C, 15 libras-fuerza por pulgada cuadrada (psi) durante 20 min, o según las recomendaciones del fabricante del autoclave.
- Vierta 15 ml de alícuotas de agar BHI esterilizado en placas de Petri estériles y deje que se asiente.
nota: Asegúrese de que todas las placas de agar que se utilicen en el ensayo procedan de la misma reserva de agar y de que haya la misma cantidad de agar en cada placa. Esto limita la variabilidad en los nutrientes disponibles y la difusión de los inhibidores entre placas, lo que permite la comparabilidad.
2. Preparación de caldo estéril
- Prepare el caldo BHI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir 10 ml de alícuotas de BHI a frascos universales de vidrio de 28 ml.
- Autoclave el caldo BHI a 121 °C, 15 psi durante 20 min, o según las recomendaciones del fabricante del autoclave, para esterilizar.
nota: Asegúrese de que todo el caldo utilizado en el ensayo se origine en el mismo lote de caldo esterilizado en autoclave al mismo tiempo para limitar la variación en los nutrientes que podría causar variaciones en los resultados.
3. Preparando la(s) botella(s) vaporizadora(s) estéril(es)
- Desmonta la botella del vaporizador.
- Rocíe un 5% de agente de limpieza tensioactivo a través del vaporizador para eliminar los contaminantes internos, y remoje la botella del vaporizador, la tapa y el vaporizador en el agente de limpieza tensioactivo al 5% durante la noche.
nota: Se deben utilizar guantes y equipo de protección personal adecuado cuando se manipulen agentes de limpieza tensioactivos.
- Seca el vaporizador, la tapa y las botellas bajo una campana de flujo de aire estéril.
- Llene la botella con etanol al 70%, vuelva a colocar el vaporizador y rocíe un poco de etanol a través del vaporizador.
- Coloque la tapa en el vaporizador y guarde el etanol en su interior hasta su uso.
- Inmediatamente antes de usar, enjuague asépticamente el frasco con caldo BHI estéril y rocíe el caldo a través del vaporizador.
nota: Esto evita que el etanol afecte al inóculo añadido a la botella en la sección 6.3.
4. Preparación de los cultivos bacterianos durante la noche
- Coloque las cepas competidoras e inhibidoras en una placa de agar BHI estéril e incube a 37 °C aeróbicamente durante aproximadamente 18 horas (toda la noche).
nota: Esta placa produce un stock de bacterias que se puede utilizar para múltiples réplicas en la misma semana cuando se almacena a 4 °C.
- Inocular 10 ml de caldo BHI estéril con una sola colonia de la cepa bacteriana competidora requerida dentro de un frasco universal de 28 ml.
- Incubar la botella universal a 37 °C aeróbicamente durante la noche agitándola a 250 rpm en un agitador orbital.
5. Cultivo puntual del aislado productor de inhibidores
- Prepare los cultivos nocturnos como se describe en la sección 4.
- Asegúrese de que las placas de agar estén completamente secas, sin condensación en la tapa, antes de la inoculación (por ejemplo, incubando la placa durante 60 minutos a 37 °C); esto evita que el inóculo se extienda por la placa desde el lugar de inoculación.
- Pipetear 25 μl del cultivo durante la noche en el centro de las placas de agar. Evite presionar completamente el émbolo de la pipeta para evitar que se formen burbujas de aire que rocíen el cultivo a través del agar.
- Deje que el cultivo se seque a temperatura ambiente para limitar la propagación del cultivo. Incubar las placas de agar a 37 °C aeróbicamente durante la noche.
6. Preparación del inóculo en aerosol de la(s) cepa(s) competidora(s) de prueba
- Prepare el cultivo nocturno como se describe en la sección 4. Diluir el cultivo durante la noche 10 veces en caldo BHI para producir aproximadamente 4 x 106 unidades formadoras de colonias (UFC) ml-1 y una suspensión de OD600 0,3 ±0,05.
nota: Una dilución de 10 veces no dará 4 x 106 UFC ml-1 para todas las especies bacterianas, calcule el factor de dilución necesario mediante diluciones en serie de recubrimiento extendido entre 1 x 10-1-1 x 10-6.
- Vierta el cultivo diluido en un frasco vaporizador de perfume de plástico estéril.
nota: El volumen total debe ser mayor que el necesario para el número de placas de agar que se rocían. Aproximadamente 250 μl por placa es adecuado para una placa de Petri de 9 cm de diámetro.
7. Ensayo de inhibición del crecimiento diferido
- Rocíe el cultivo a través de cada una de las botellas del vaporizador para asegurarse de que el cultivo se cargue en el mecanismo de pulverización antes de rociar sobre el agar.
- Desde una distancia de aproximadamente 15 cm por encima del agar, rocíe aproximadamente 250 μl de cultivo diluido (3 pulverizaciones de un vaporizador típico de 50 ml) sobre toda la superficie del agar. Incubar las placas de agar a 37 °C aeróbicamente durante la noche. Repita para otras placas con el mismo número de pulverizaciones.
8. Interpretación de los resultados del ensayo de inhibición del crecimiento diferido
- Mida la zona de inhibición del crecimiento de la cepa competidora rociada (Figura 1A-C, "X" a "X") en milímetros, restando el diámetro del punto central del inhibidor-productor (Figura 1A-C, "Y" a "Y").
NOTA: La Figura 1E muestra cómo se podrían presentar estos datos
- Registre la puntuación de claridad para las zonas de inhibición.
nota: Esto indica el grado de inhibición observado. En la Figura 1A-D se muestran ejemplos, las cepas que se pueden utilizar para la estandarización se sugieren en la sección de resultados representativos. Se puede utilizar la siguiente escala para la puntuación de claridad: una puntuación de claridad de 0 para describir una zona de inhibición completa del crecimiento de la cepa competidora. Una puntuación de 1 describe una zona de inhibición casi completa del crecimiento, con solo colonias individuales presentes en la zona de claro. Una puntuación de 2 describe una zona visible de crecimiento reducido, el crecimiento dentro de esta zona es confluente o casi confluente pero reducido en densidad en un >50 %. Una puntuación de 3 describe solo una reducción mínima del crecimiento, el crecimiento es confluente y se reduce en menos del 50 %, y una zona sigue siendo visible y medible. Una puntuación de 4 describe que no hay inhibición visible del crecimiento. Una puntuación de 5 describe que el crecimiento de la cepa competidora aumentó en la proximidad de la cepa productora de inhibidores de la prueba. Consulte la Figura 1 para ver ejemplos. Estas puntuaciones son subjetivas para el experimentador.
