Un ensayo para cuantificar Salmonella citosólica y vacuolar en macrófagos primarios infectados

Resumen

Fuente: Meunier, E., et al. Cuantificación de Salmonella citosólica vs. Vacuolar en macrófagos primarios mediante permeabilización diferencial. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra un ensayo para cuantificar Salmonella typhimurium citosólico y vacuolar dentro de macrófagos derivados de la médula ósea utilizando permeabilización diferencial. Los macrófagos están infectados con una proteína fluorescente que expresa Salmonella, que se internaliza dentro de una estructura vacuolar especializada llamada vacuola que contiene Salmonella o SCV. Un subconjunto de bacterias escapa del VCS y entra en el citosol. La membrana plasmática rica en colesterol de los macrófagos se permeabiliza mediante digitonina, dejando intacto el VCS. Al marcar las bacterias citosólicas con un anticuerpo marcado con fluorescencia, el porcentaje de bacterias vacuolares y citosólicas se cuantifica mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Protocolo

>1. Ensayo de digitonina con Salmonella que expresa mCherry (análisis basado en FACS)

1. Preparación de bacterias
   Nota: En este ensayo se utiliza Salmonella wild-type SL1344 (resistente a la estreptomicina) que expresa mCherry a partir de un plásmido (pFPV que codifica mCherry bajo el promotor rpsM). La fagocitosis y proliferación bacteriana no se vieron alteradas por la expresión constitutiva de mCherry (datos no mostrados).
   1. Inocular la cepa 1 día antes de la infección en 3 ml de medio LB suplementado con estreptomicina (90 μg/ml) y ampicilina (100 μg/ml, vector expresante mCherry) en un agitador a 37 °C O/N.
2. Colocación de placas en las células para la infección.
   1. Siembre BMDM de tipo salvaje en una placa de 24 pocillos a una densidad de 1,25 x 10⁵ células/pocillo en 1 ml de medio macrófago primario (DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS, inactivado por calor, 56 °C, 30 min), 1% de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de L-glutamina y 10% de sobrenadante L929 (medio condicionado a partir de células productoras de células L929 del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)). Los pozos de siembra de acuerdo con la Tabla 1 tienen en cuenta las condiciones individuales. Agregue cubreobjetos a los pozos utilizados como controles (Tabla 1).
   2. Incubar las células durante la noche en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
3. Preparar las bacterias para la infección.
   1. Al día siguiente, determine la concentración de Salmonella en el cultivo durante la noche diluyendo el cultivo 1:10 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y midiendo el OD₆₀₀ contra un control de PBS solamente. Esto garantiza que el diámetro exterior₆₀₀ se mida en el rango lineal del espectrofotómetro.
   2. Calcular la concentración de Salmonella por ml. Un OD₆₀₀ de 1 corresponde a 1 x 10⁹ bacterias.
   3. Diluir las bacterias en un medio macrófago para alcanzar una concentración de Salmonella de 1,25 x 10⁶ células/ml.
4. Infección de células con Salmonella.
   1. Agregue 1 ml de medio macrófago a los pocillos de control no infectados (B1-B3, C1-C3). Añadir 1 ml de suspensión de Salmonella a los pocillos A1 - A5 para alcanzar una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 10 bacterias por célula.
   2. Centrifugar la placa durante 15 min a 300 x g a 37 °C para sincronizar la infección. Transfiera la placa a una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
5. Matar la Salmonella extracelular con gentamicina.
   1. 1 hora después de la infección, retire la placa de la incubadora y añada 0,1 ml de medio macrófago que contenga 0,1 mg/ml de gentamicina para matar las bacterias extracelulares. Agregue gentamicina a todos los pocillos, incluso a los controles no infectados, para garantizar que todas las células se traten de la misma manera. Transfiera la placa a una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
6. Lavar las células.
   1. A las 2 horas después de la infección, retire la placa de la incubadora y lave todos los pocillos 2 veces con 1 ml de DMEM simple (precalentado a 37 °C) y reemplácelo con medio macrófago (precalentado a 37 °C) que contenga 10 μg/ml de gentamicina para evitar el crecimiento de cualquier bacteria extracelular restante. Transfiera la placa a una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
7. Preparación de tampones frescos con detergentes y anticuerpos.
   1. Justo antes del punto de tiempo deseado para el análisis, prepare una solución madre fresca de digitonina a 1 mg/ml en tampón KHM (110 mM de acetato de potasio, 20 mM de HEPES, 2 mM de MgCl₂, pH 7,3). Filtrar el caldo y diluir en tampón KHM hasta una concentración de trabajo de 50 μg/ml de digitonina. Además, prepare una solución de saponina al 0,1% en tampón KHM, anticuerpo anti-Salmonella acoplado a isotiocianato de fluoresceína (CSA-1-FITC) a 1/500, anticalnexina a 1/100 o isomerasa disulfuro de proteínas (anti-PDI) a 1/100 en tampón KHM suplementado con albúmina sérica bovina (BSA) al 3%.
8. Permeabilización celular.
   1. Retire la placa de la incubadora y lave los pocillos 3 veces con 0,5 ml de tampón KHM (precalentado a 37 °C). Retire el tampón KHM y agregue 0,25 ml de tampón KHM simple a los pocillos A4 y B1/C1, tampón KHM con digitonina a los pocillos A1 - A3 y B2/C2, o tampón KHM con saponina a los pocillos A5 y B3/C3 (según la Tabla 1). Incubar durante exactamente 1 minuto en RT y lavar inmediatamente todos los pocillos 3 veces con 0,5 ml de tampón KHM (precalentado a 37 °C).
9. Tinción primaria de anticuerpos.
   1. Retire el tampón KHM y agregue las soluciones de anticuerpos primarios (anti-Salmonella-FITC de cabra, 250 μl/pocillo, 0,1 μg/ml) a los pocillos apropiados (Figura 1, Tabla 1). Incubar la placa durante 15 min en una incubadora a 37 °C y 5% de_CO2.
   2. Lave las células 1 vez con 1 mL de PBS.
10. Células infectadas (pocillos A1 - A5): análisis FACS
    1. Lave las celdas 3 veces con PBS y agregue 0,5 ml de PBS helado que contenga 0,1% de Triton. Transfiera a un tubo FACS de 5 mL con una tapa de filtro de células para romper los agregados de células. Mantenga las muestras en hielo.
    2. Analice las muestras de FACS. Con los controles totalmente permeabilizados, configure primero la puerta para el total de bacterias en función de la dispersión frontal y lateral (FSC/SSC) y la señal mCherry (filtro de 610 nm ± 20 nm).
    3. A continuación, analice la señal de FITC en la población bacteriana total utilizando los controles totalmente permeabilizados y no permeabilizados para establecer las puertas para las bacterias citosólicas (FITC+, mCherry+) y las bacterias vacuolares (FITC-, mCherry+) (Figura 2).
    4. Con las puertas configuradas, analice las muestras y determine el porcentaje de bacterias citosólicas frente a vacuolares utilizando el software FlowJo de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Tabla 1: Esquema de siembra para macrófagos derivados de la médula ósea (BMDMs) en un formato de 24 pocillos para la posterior infección por Salmonella, permeabilización y tinción.

		Permeabilización		Tinción
	Cubreobjetos de vidrio	Salmonella	Digitonin	saponina	anti-Salmonella	anti-Calnexin	anti-PDI
A1 (muestra)	-/+*	+	+		+
A2 (muestra)	-/+*	+	+		+
A3 (muestra)	-/+*	+	+		+
A4 (sin control de permeabilización)	-/+*	+			+
A5 (control de permeabilización completa)	-/+*	+		+	+
B1 (teñido para calnexina)	+					+
B2 (teñido para calnexina)	+		+			+
B3 (teñido para calnexina)	+			+		+
C1 (teñido para PDI)	+						+
C2 (teñido para PDI)	+		+				+
C3 (teñido para PDI)	+			+			+

Resultados

Figura 1. Representación esquemática del protocolo 1. Las células infectadas que contienen Salmonella mCherry positiva, ya sea en vacuolas intactas o en el citosol, se permeabilizan diferencialmente con digitonina. Las Salmonella citosólicas se tiñen con anti-Salmonella acoplado a FITC. Las células se lavan y lisan con Triton X-100 para el análisis FACS. Las células de cont...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Digitonin	sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Tecnologías de la Vida	15630
Acetato de potasio	sigma	791733
MgCl2	sigma	M8266
Bsa	sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Ciencias de la Vida	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Ciencias de la Vida	SPA-890	1/100
saponina	sigma	47036
Medio de montaje Vectashield	Laboratorios vectoriales	H-1200
Anticuerpo anti conejo-488	Sondas moleculares	A-11070	1/500
gentamicina	Tecnologías de la Vida	15710-49	100ug/mL y 10ug/mL
Tritón X-100	Promega	H5141
Pbs	Gibco	20012-019
DMEM	sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	Tecnologías BD		detección mCherry 610 nm
FACS Fortessa	Tecnologías BD		detección FITC 530 nm