Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación tampón para la recolección de sangre humana y el aislamiento de plaquetas lavadas
- Prepare una solución acuosa de 100 mL de ácido-citrato-dextrosa (ACD) disolviendo 1,4 g de ácido cítrico monohidratado (C6H8O7•H2O, 66,6 mM), 2,5 g de citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) y 2 g de D(+)-glucosa anhidra. El pH de la solución es de aproximadamente 4,5.
- Prepare las soluciones madre para el tampón de Tyrode de la siguiente manera
- Prepare la solución madre 1 disolviendo 80 g de cloruro de sodio (NaCl), 2 g de cloruro de potasio (KCl), 10 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 0,58 g de dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado (NaH2PO4*H2O) en 500 mL de H2O destilado. Las concentraciones finales respectivas son 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM y 8,4 mM. Mantenga la solución a 4 °C.
- Prepare la solución madre 2 disolviendo 10,15 g de dicloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2*6 H2O) (100 mM) en 500 mL de agua destilada (H2O). Mantenga la solución a 4 °C.
- Prepare la solución madre 3 disolviendo 10,95 g (100 mM) de cloruro de calcio hexahidratado de CaCl2*6 H2O en 500 mL de H2O destilado. Mantenga la solución a 4 °C.
- Prepare el tampón Tyrode diluyendo 2,5 mL de solución madre 1 en un volumen final de 50 mL con H2O destilado. Esto corresponde a concentraciones finales de 136,5 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 11,9 mM de NaHCO3 y 0,42 mM de NaH2PO4*H2O. Ajustar el pH a 7,35 y esterilizar filtrando con filtros de 0,22 μm.
- Preparar el tampón de albúmina al 0,35% de Tyrode (tampón TA) diluyendo 5 mL de solución madre 1, 1 mL de solución madre 2, 2 mL de solución madre 3, 0,5 mL 1M HEPES, 1,8 mL de 200 g/L de albúmina sérica humana y 0,1 g de D(+)-glucosa anhidra en un volumen final de 100 mL de H2O. destilado.
- Ajustar el pH a 7,35 con ácido clorhídrico 1N (HCl) y ajustar la osmolaridad a 295 mOsm/L añadiendoH2Odestilado (10% del volumen total). Las concentraciones finales en esta solución son 124 mM de NaCl, 2,44 mM de KCl, 10,82 mM de NaHCO3, 0,38 mM de NaH2PO4*H2O, 0,91 mM de MgCl2*6 H2O, 1,82 mM de CaCl2*6 H2O. Mantenga el tampón de TA a 37 °C durante todo el experimento.
>2. Recolección de sangre
- Recoger 45-50 mL de sangre venosa, de la vena antecubital utilizando una aguja de 19 G y sin torniquete o con torniquete bajo, en tubos de 50 mL que contengan anticoagulante ACD (1 volumen de ACD por 6 volúmenes de sangre). Deseche los primeros 1-2 mL de sangre para evitar la presencia de trombina y factor tisular.
- Después de la recolección, mezcle la sangre con el ACD invirtiendo suavemente el tubo. Incubar la muestra durante 10 min a 37 °C.
>3. Preparación de plaquetas humanas lavadas
- Precalentar la centrífuga a 37 °C. Todos los pasos de centrifugación a continuación se realizan a esta temperatura.
- Enviar la sangre recolectada a tubos de 15 mL (5 mL por tubo) y centrifugar a 250 x g durante 13 min para obtener plasma rico en plaquetas, PRP.
nota: Este paso de centrifugación da como resultado la producción de tres capas en la muestra: 1) La capa superior, compuesta por plasma, plaquetas y una pequeña fracción de glóbulos blancos. 2) La capa intermedia, una porción rica en glóbulos blancos. 3) La capa inferior, que está compuesta esencialmente por glóbulos rojos.
- Recoja el PRP pipeteando cuidadosamente la capa superior en un nuevo tubo de 15 ml para evitar al máximo la contaminación con glóbulos rojos y blancos, e incube durante 10 minutos a 37 °C.
- Centrifugar el PRP a 2.200 x g durante 12 min (para 5 mL de PRP).
nota: Este paso de centrifugación debe realizarse con freno bajo o sin freno.
- Retire el sobrenadante (plasma pobre en plaquetas) y vuelva a suspender cuidadosamente el pellet con 10 mL de tampón TA que contenga 2 μL/mL de heparina (5.000 U/mL) y 2,5 μL/mL de prostaciclina 25 μM (PGI2) utilizando una pipeta Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 °C.
- Añadir 2,5 μL/mL de 25 μM de prostaciclina-I2 (PGI2) y centrifugar durante 8 min a 1.900 x g (con freno bajo o sin freno).
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 5 mL de tampón TA que contenga 2,5 μL/mL de 25 μM PGI2 utilizando una pipeta Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 °C.
- Durante el período de incubación, pipetee 150 μL de la suspensión de plaquetas en un tubo de 1,5 mL y cuente las plaquetas, utilizando un contador de células automatizado (que detecta el tamaño de las células sanguíneas midiendo los cambios en la resistencia de corriente continua).
- Después de los 10 min de incubación, añadir 2,5 μL/mL de 25 μMPGI2 a la suspensión de plaquetas y centrifugar inmediatamente a 1.900 x g durante 8 min.
- Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet hasta una concentración de 250.000 plaquetas/μL con un volumen adecuado de tampón TA (es decir, si el recuento de células es de 500.000 por μL, volver a suspender en tampón TA de 10 mL) que contenga 32 μL/mL de apirasa a 0,01 U/mL (concentración final 0,32 U/mL)
nota: Se utiliza una alta concentración de apirasa para evitar la desensibilización de los receptores P2X purinoceptor 1, P2X1 inducida por la secreción espontánea de trifosfato de adenosina (ATP) en ausencia de agonistas. Esto es importante porque las respuestas inducidas por el colágeno son inducidas por la rápida activación paracrina/autocrina de P2X1 por el ATP liberado por las plaquetas activadas. Si la vía de señalización plaquetaria no requiere críticamente la preservación de la función P2X1, use apirasa 0,02 U/mL. Varios estudios demostraron que la apirasa 0,02 U/mL evita el receptor P2Y de adenosina difosfato ADP purinoceptor 1 y la desensibilización P2Y1 con respuestas P2X1 insignificantes.
- Incubar la suspensión celular durante al menos 30 minutos a 37 °C antes de realizar las mediciones agregadométricas. La preparación es estable de 5 a 8 horas.
>4. Aggregometría
- Prepare fibrinógeno (56 mg/mL) en el tampón Tyrode.
- Pipetear 260 μL de suspensión de plaquetas en cubetas de vidrio (Figura 1A; cubeta izquierda) que contienen 10 μL de fibrinógeno (56 mg/mL) y una varilla de agitación magnética, luego incubar la suspensión durante 2 - 3 min a 37 °C en pocillos de incubación presentes en el agregador (Figura 1B y 1C).
- Preincubar con el inhibidor de Panx1 Brilliant Blue FCF añadiendo 10 μL de una solución madre de 2,8 mM o 28 mM (concentración final de 100 μM y 1 mM, respectivamente) durante 7 min a 37 °C.
- Calibre el agregador a un valor de agregación supuesto del 100% midiendo la densidad óptica (OD) de una cubeta que contiene 10 μL de fibrinógeno (56 mg/mL), 10 μL de Brilliant Blue FCF (2,8 mM o 28 mM) y tampón TA sin plaquetas.
- Coloque la cubeta en un pocillo de agregación bajo agitación automática y presione el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada al agregador (es decir, presione F1 si se usa el pocillo de agregación 1)
nota: Este experimento que se describe a continuación incluye Brilliant Blue FCF. El compuesto utilizado para la calibración debe ajustarse a la condición experimental.
- Calibre el agregador a un valor de agregación supuesto del 0% utilizando la misma muestra de plaquetas que se utilizará para el experimento bajo agitación automática.
- Coloque la cubeta en el pozo de agregación y presione el botón correspondiente en el teclado de la computadora vinculada al agregador. Espere unos 20-30 segundos antes de continuar. Este retraso sirve para asegurar que no ocurra ninguna agregación antes de agregar los agonistas.
nota: Dado que cualquier diferencia en el número de plaquetas puede tener un efecto en la DO medida, el paso de calibración del 0% debe repetirse para cada medición individual.
- Añadir 20 μL del agonista deseado, como 15 μg/mL de colágeno (1 μg/mL final) o 1,125 mM de ácido araquidónico (75 μM final), en la cubeta. Inicie inmediatamente la grabación bajo agitación automática continua presionando el botón correspondiente en el teclado de la computadora conectada al agregador.
nota: La adición del agonista induce la activación plaquetaria. Los agregados de plaquetas se pueden distinguir claramente en la cubeta de vidrio al final del experimento (Figura 1A; cubeta derecha).
- La grabación se detiene automáticamente después de 6 minutos. En este punto, guarde los datos haciendo clic en el icono de guardar en la computadora.
nota: El cálculo de la tasa de agregación lo realiza la computadora, que expresa los resultados finales del proceso de agregación como un porcentaje.
