>NOTA: Todos los pasos descritos en las secciones 1 y 2 se llevan a cabo en condiciones estériles en una cabina de flujo laminar.
1. Mantenimiento de U87. Células CD4.hCXCR4
- Cultive las células en matraces de cultivo T75 a 37 °C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
nota: La línea celular in vitro utilizada en este protocolo es una línea celular de glioblastoma U87 que expresa de manera estable el grupo de diferenciación 4 (CD4) y el receptor de quimiocinas CXC humano 4 (CXCR4) y ha sido descrita previamente. La expresión de la superficie celular de CD4 y CXCR4 se monitorea continuamente mediante citometría de flujo y los niveles de expresión permanecen constantes a lo largo del tiempo (~ 100% de células CD4+ y ~ 100% CXCR4+). Una descripción detallada de la generación de la línea celular utilizada y del procedimiento de citometría de flujo para investigar los niveles de expresión del receptor no está dentro del alcance de este protocolo.
- Células de subcultivo al 80-85% de confluencia. Permita que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente (RT) antes del cultivo celular.
- Retire el medio de cultivo acondicionado de las células y lave la monocapa celular una vez con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Añadir 3 mL de ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina al 0,25% (tripsina-EDTA) y distribuirlo uniformemente sobre la monocapa celular. A continuación, retire el exceso de tripsina-EDTA e incube hasta 5 minutos a 37 °C hasta que las células comiencen a desprenderse.
- Añadir 10 mL de medio de crecimiento completo fresco (Dulbecco's Modified Eagle ́s Medium (DMEM) + 10% de suero fetal bovino (FBS) + 0,01 M de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) + agentes de selección adecuados). Vuelva a suspender las células pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 50 mL.
- Cuente el número de células viables utilizando el método de su elección. En el caso de las células de glioblastoma U87, la viabilidad generalmente alcanza ~ 100%.
nota: Los números de celda se pueden determinar de varias maneras. Utilizamos habitualmente un sistema automatizado de análisis de células basado en la tinción con azul de tripano (ver Tabla de Materiales) de acuerdo con sus procedimientos de manejo estándar, pero otras formas deberían funcionar igualmente bien.
- Añadir 2 x 106 o 3 x 106 células (viables) a un volumen final de 25 mL de medio de crecimiento fresco en un matraz de cultivo T75 e incubar a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO2).
nota: Si se utilizan 3 x 106 celdas, las celdas alcanzarán un 80-90% de confluencia después de 2 días. Si se utilizan 2 x 106 celdas, alcanzarán la misma confluencia después de 3 días. La tasa de crecimiento de las células debe determinarse primero empíricamente si se utilizan otras líneas celulares.
>2. Siembra de las células para el ensayo de movilización de Ca2+
- El día del paso de las células (día 0), cubra las placas de poliestireno de 96 pocillos de paredes negras con fondos transparentes (consulte la Tabla de materiales) con una solución de gelatina al 0,1% para facilitar la unión de las células.
nota: El recubrimiento de las placas de 96 pocillos con gelatina puede omitirse si se utilizan placas prerrevestidas, que están disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales). Se recomienda evaluar el uso de placas prerrevestidas en lugar de recubrimiento manual para cada línea celular bajo investigación antes de continuar con el protocolo.
- Prepare la solución de gelatina añadiendo 1 g de gelatina a 100 mL de PBS para obtener una solución al 1%. Diluir 10 veces con PBS antes de seguir usando. Para mejorar la solubilidad de la gelatina, calentar la solución a 37 °C.
- Añada 100 μL de solución de gelatina al 0,1% por pocillo de la placa de 96 pocillos con una pipeta multicanal. Incubar durante 2 h a RT.
- Mientras tanto, prepare las celdas para la siembra en la placa recubierta de 96 pocillos.
- Separe las células del matraz de cultivo, vuelva a suspenderlas en el medio de crecimiento fresco y cuéntelas utilizando el método de tinción con azul de tripán.
- Gire las células en un tubo de 50 ml durante 5 minutos a 400 x g en RT.
- Resuspender las células en un medio de crecimiento fresco (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, sin antibióticos) para obtener una densidad celular de 0,1 x 106 células (viables)/mL.
- Retire la solución de gelatina de las placas de paredes negras con un fondo transparente volteando la placa y secándola en un pañuelo de papel. Agregue 200 μL / pocillo de PBS para eliminar el exceso de gelatina y vuelva a voltear el plato.
- Dispensar 200 μL de la suspensión celular (correspondiente a 0,2 x 105 células) por pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de gelatina (a partir de ahora, esta placa se denominará "placa de medición").
- Incubar la placa durante la noche a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO2).
>3. Carga de las células con un colorante fluorescente sensible al Ca2+
- El día 1 se realiza el ensayo de movilización de Ca2+ propiamente dicho, comenzando con la carga de las células sembradas con el colorante fluorescente de unión a Ca2+ fluo-2 acetoximetilo (fluo-2 AM).
- Prepare el tampón de ensayo agregando 40 mL de HEPES (1 M) a 200 mL de solución salina balanceada de Hank's (HBSS, 10x, sin rojo de fenol, sin bicarbonato de sodio). Añadir agua ultrapura para obtener un volumen final de 2 L y añadir 4 g de albúmina sérica bovina (BSA). Disuelva el BSA mediante agitación magnética. Ajuste el pH a 7.4 (con hidróxido de sodio, NaOH) y filtre la solución.
nota: Durante todos los pasos siguientes, se utiliza el mismo tampón, denominado "tampón de ensayo".
- Prepare una solución madre (4 mM en dimetilsulfóxido (DMSO)) del colorante fluorescente sensible al Ca2+ fluo-2 AM. Evite la exposición excesiva a la luz. Disolver 1 mg de fluo-2 AM (peso molecular: 1.061 g/mol) en 235,6 μL de DMSO.
- Prepare una solución de trabajo de fluo-2 AM. Para una placa de ensayo de 96 pocillos, mezcle 12,5 μL de solución madre de fluo-2 AM (4 mM) y 12,5 μL de solución de poliol surfactante no iónico (por ejemplo, pluronic f-127) (20% peso/volumen en DMSO, consulte la Tabla de materiales). Añada 22 μL de esta mezcla a 11 mL de tampón de ensayo en un tubo de 15 mL. La concentración final de fluo-2 AM es de 4 μM.
nota: El tensioactivo no iónico se utiliza como agente de dispersión para mejorar la solubilidad acuosa de fluo-2 AM y, en consecuencia, para mejorar la carga celular. Para solubilizar el tensioactivo en DMSO, caliente la muestra a 37 °C y mezcle regularmente para obtener una solución homogénea.
- Retire el medio de crecimiento de las células previamente sembradas en la placa de medición de 96 pocillos volteando la placa y secándola con una toalla de papel.
- Añadir 100 μL de solución de colorante de carga por pocillo utilizando una pipeta multicanal e incubar durante 45 min en RT a oscuras.
>4. Preparación de placas de polipropileno de 96 pocillos que contienen el ligando de quimiocina CXC ligando 12 de quimiocinas (CXCL12) o los compuestos bajo investigación
- Obtenga placas de polipropileno (PP) de 96 pocillos de fondo redondo (consulte la tabla de materiales).
- Permitir que la solución madre de CXCL12 (1 mg/mL) y la solución madre de los compuestos bajo investigación se equilibren a RT.
nota: La solución madre de CXCL12 se prepara en agua ultrapura suplementada con 0,01% de Tween20 y se almacena a -20 °C como alícuotas de un solo uso.
- Prepare una solución concentrada 5 veces mayor de CXCL12 en tampón de ensayo (250 ng/mL, lo que equivale a 31,25 nM) y una dilución concentrada 5 veces mayor de cada compuesto (en tampón de ensayo).
- Dispense las soluciones madre en la placa de 96 pocillos adecuada de acuerdo con un diseño de placa predefinido. Dispense 75 μL/pocillo en la placa que contiene CXCL12 (la "placa de quimiocinas") y dispense 50 μL/pocillo en la placa que contiene los compuestos (la "placa compuesta").
nota: Ambos compuestos y CXCL12 finalmente se diluirán 5 veces al dispensarlos en la placa de medición. También es importante incluir pocillos de control negativo que contengan solo tampón de ensayo tanto en la placa compuesta como en la placa de quimiocinas. Además, se deben incluir pocillos de control positivo (es decir, pocillos con CXCL12 en la placa de quimiocina, pero con tampón de ensayo en los pocillos correspondientes de la placa compuesta).
>5. Ajustes de protocolo en el lector de microplacas de fluorescencia
NOTA: El lector de microplacas de fluorescencia utilizado en este protocolo se menciona en la Tabla de Materiales.
- Encienda primero la unidad de enfriamiento del lector de placas de fluorescencia y, a continuación, encienda el propio lector de fluorescencia. Deje que se inicie durante unos minutos y abra el software del sistema.
- Cree el protocolo del ensayo mediante el menú de arrastrar y soltar que incluye los siguientes pasos:
- En el cuadro "Configuración", seleccione 'Read_Mode' con longitud de onda de excitación: 470-495 nM; y longitud de onda de emisión: 515-575 nM.
nota: Las longitudes de onda seleccionadas son apropiadas para su uso con el colorante fluo2 sensible al Ca2+.
- Incluya la caja "Mezclar con TF" (fluido de transferencia) para la mezcla automática de los compuestos en la placa de compuesto, que se colocará en la fuente 2 posiciones del dispositivo (ver paso 6.4). Seleccione 15 μL de solución en cada pocillo para aspirar automáticamente y mezclar tres veces. Ajuste la altura de las puntas de pipeta a 20 μL por debajo de la superficie del líquido. Ajuste la velocidad de aspiración y dispensación a 50 μL/s.
nota: La altura de las puntas de pipeta se refiere al volumen que queda debajo de las puntas de pipeta. Por ejemplo, si los pocillos de una placa compuesta contienen 50 μL, una altura de 30 μL corresponde a 20 μL por debajo de la superficie del líquido. El volumen de solución compuesta que se necesita mezclar, la velocidad de mezcla, la posición de las puntas de pipeta durante la mezcla y el número de ciclos de mezcla se pueden ajustar mediante el software.
- En el cuadro "Fluido de transferencia", defina que 20 μL de cada pocillo de la placa compuesta se transferirán a la placa de medición. Coloque las puntas de pipeta a 20 μL por debajo de la superficie del líquido, es decir, a una altura de 30 μL durante la aspiración de los compuestos y a una altura de 60 μL durante la dispensación en la placa de medición. Ajuste la velocidad de aspiración a 50 μL/s y la velocidad de dispensación a 25 μL/s.
nota: La placa compuesta contiene 50 μL de solución por pocillo (ver paso 4.1.3), por lo que una altura de 30 μL corresponde a una posición de 20 μL por debajo de la superficie del líquido. La placa de medición contendrá 80 μL de tampón de ensayo por pocillo (consulte el paso 6.3), por lo que una altura de 60 μL corresponde a una posición similar de las puntas.
- Seleccione el botón "Leer con TF". Durante el primer intervalo, seleccione 60 lecturas (mediciones fluorescentes) con un tiempo de intervalo de lectura de 1 s. Defina que se registren 10 lecturas antes de dispensar los compuestos en la placa de medición y 50 lecturas después. Defina el segundo intervalo con un intervalo de tiempo de lectura de 30 segundos y 18 lecturas.
nota: Durante este paso, la fluorescencia se medirá cinéticamente (en los intervalos de tiempo definidos) durante ~ 10 minutos en total.
- Incluya el botón "Consejos de lavado" en el protocolo tres veces. Dentro de cada paso de lavado, seleccione el tipo de fluido: fluido A (agua ultrapura) o fluido B (70% etanol), el número de ciclos de lavado (1), la velocidad de la bomba (Rápido) y el número de carreras (5) durante cada paso de lavado.
nota: Durante el primer y último paso de lavado se utiliza el fluido A, durante el segundo paso de lavado se utiliza el fluido B.
- Incluye la función "Pause Pipettor". Configure la pipeta para que se detenga durante 300 s.
nota: Al incluir este paso en el protocolo, el cabezal de la pipeta, que está integrado en el dispositivo lector de placas de fluorescencia, se detendrá durante 5 minutos antes de continuar con el protocolo.
- Incluya la caja "Mezclar con TF" para permitir la mezcla automática de la solución CXCL12 en la placa de quimiocina, que se colocará en la posición de la fuente 3 del dispositivo (consulte el paso 6.4). Seleccione 15 μL de solución en cada pocillo para aspirar automáticamente y mezclar tres veces. Durante la aspiración y la mezcla, coloque las puntas de pipeta a 20 μL por debajo de la superficie del líquido. La velocidad de aspiración y dispensación se establece en 50 μL/s.
nota: Al igual que en el paso 5.2.2, estos parámetros se pueden ajustar.
- En el cuadro "Fluido de transferencia" posterior, defina que 25 μL de cada pocillo de la placa de quimiocinas se transferirán a la placa de medición. Coloque las puntas a 20 μL por debajo de la superficie del líquido, es decir, a una altura de 55 μL durante la aspiración de la placa de quimiocinas que contiene 75 μL/pocillo (consulte el paso 4.1.3), y a una altura de 80 μL durante la dispensación en la placa de medición. Ajuste la velocidad de aspiración a 50 μL/s y la velocidad de dispensación a 25 μL/s.
- Incluye el botón "Leer con TF". Durante el primer intervalo, seleccione 145 lecturas con un tiempo de intervalo de lectura de 1 s. Defina que se registren 5 lecturas antes de dispensar CXCL12 en la placa de medición y 140 lecturas después. Defina el segundo intervalo con un intervalo de tiempo de lectura de 6 s y seleccione 20 lecturas.
nota: En conjunto, a lo largo de todo el protocolo se registran 243 lecturas (mediciones fluorescentes): 78 en el paso 5.2.4 y 165 durante el paso 5.2.9.
- De manera similar al paso 5.2.5, incluya el botón "Consejos de lavado" tres veces en el protocolo.
nota: Incluir este paso al final del protocolo permite que las puntas se puedan reutilizar para realizar otro ensayo sin necesidad de cambiar las puntas.
- Ajuste la temperatura del dispositivo a 37 °C haciendo clic en el botón "Establecer temperatura de la etapa" y seleccionando 37 °C.
>6. Ejecución del ensayo de fluorescencia
- Después de que la placa de medición se haya incubado con tampón de carga durante 45 min (consulte el paso 3.1.5), retire el tampón volteando la placa y séquela sobre un pañuelo de papel.
- Lave las células sembradas añadiendo 150 μL/pocillo de tampón de ensayo e incube durante 2 min.
- Vuelva a retirar el tampón volteando la placa. Añada 80 μL/pocillo de tampón de ensayo con una pipeta multicanal.
- Coloque todas las placas en el dispositivo en su posición adecuada: la placa compuesta en la posición de la fuente 2, la placa de quimiocina en la posición de la fuente 3 y la placa de medición en la posición de lectura. Coloque una caja de puntas negras en la posición de las puntas de la fuente 1. Cierre la puerta del dispositivo e incube durante 5 minutos antes de continuar con el protocolo.
- Seleccione el botón "Prueba de señal de protocolo" para determinar las unidades de luz relativa (RLU) de fondo y la variación de fluorescencia sobre la placa. Aparecerá una nueva ventana. Seleccione "Señal de prueba".
nota: Durante este paso, las RLU de fondo se determinan mediante la cámara del dispositivo de carga acoplada intensificada (ICCD), que está integrada en el compartimento óptico del dispositivo lector de fluorescencia. Estas RLUs son el resultado de la excitación del colorante sensible al Ca2+ (fluo-2) por diodos emisores de luz (LED) (longitud de onda de salida del LED: 470-495 nm). Los valores de 8.000-10.000 RLUs son adecuados para esta aplicación. Si es necesario, las RLU se pueden adaptar cambiando la intensidad de excitación (Select Exc. Intensity) o la puerta de la cámara (Select Gate Open). Lo ideal es que la varianza sobre la placa sea inferior al 7,5%.
- Seleccione "Actualizar" si se obtienen valores de fondo de 8.000-10.000 RLU. Guarde el protocolo principal haciendo clic en el botón Guardar.
nota: Al hacerlo, la configuración de la prueba de señal del protocolo se transferirá al protocolo principal.
- Ejecute el ensayo pulsando el botón "RUN".
