>1. Recolección de células y medición de la actividad de la α-galactosidasa A o ácido α-glucosidasa
- Recolección de células
- El día de la cosecha, retire las células de la incubadora y aspire el medio. Lave cuidadosamente las células 2 veces con PBS con Ca2+ y Mg2+.
NOTA: Este paso es crítico porque DGJ y DNJ son inhibidores potentes de la α-galactosidasa y la α-glucosidasa, respectivamente, y cualquier resto invalidaría la prueba.
- Añadir 200 μL de agua desionizada directamente sobre las celdas. Enjuague las células de la placa y transfiéralas a un tubo de reacción de 1,5 mL.
>2. Homogeneización por congelación y descongelación
- Coloque las muestras en una rejilla de espuma y vórtice adecuados durante 5 s para que la lisis sea más eficiente. Poner las muestras alternadas en nitrógeno líquido durante 10 s y en un baño de agua a temperatura ambiente hasta completar la descongelación (5 min).
- Repita este procedimiento 5 veces y luego centrifugue las muestras durante 5 minutos a 10.000 x g. Conserve el sobrenadante y la pipeta en un nuevo tubo de reacción.
>3. Determinación de la concentración de proteínas mediante el ensayo de ácido biincónico (BCA)
- Prepare un tubo nuevo para cada muestra que contenga 40 μL deH2Odesionizado y añada 10 μL de la muestra. Mezcle la solución mediante vórtice brevemente y transfiera 10 μL a una cavidad de una placa de 96 pocillos (cada muestra por triplicado). Diluir una solución madre de 2 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) en H2O desionizado de la siguiente manera para obtener una curva estándar: 50 μLH 2O/50 μL BSA; 60 μL H2O/40 μL BSA; 70 μL H2O/30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O.
- Inicie la reacción añadiendo 200 μL de reactivo BCA (reactivo A y reactivo B mezclados en una proporción de 50:1) e incube durante 1 h en la oscuridad a 37 °C bajo una ligera agitación en un agitador orbital (300 rpm). Mida la absorbancia a 560 nm en un lector de placas.
nota: Las muestras suelen contener entre 1 y 1,5 μg de proteína por μL.
4. Medición de la actividad enzimática con sustratos artificiales de 4-Methylumbelliferyl (4-MUG)
- Diluir la cantidad calculada de cada muestra y pipetear en tubos de reacción nuevos de 1,5 ml para obtener soluciones de 0,05 (para la α-galactosidasa A) o 0,5 (para la α-glucosidasa ácida) μg de proteína/μL. Vuelva a agitar las muestras durante 5 s y pipetee 10 μL de esta dilución en una placa de 96 pocillos (cada muestra por duplicado).
- Inicie la reacción añadiendo 20 μL de la solución de sustrato respectiva:
Para α-galactosidasa A: 2 mM 4-metilumbeliferol-α-D-galactopiranósido (4-MU-gal) en tampón de citrato de fosfato 0,06 M, pH 4,7.
Para α-glucosidasa ácida: 2 mM 4-metilumbeliferol α-D-glucopiranósido (4-MU-glu) en acetato de sodio 0,025 M, pH 4,0.
- Incubar las reacciones enzimáticas durante 1 h en la oscuridad a 37 °C bajo una ligera agitación en un agitador orbital (300 rpm). Finalice la reacción mediante la adición de 200 μL de tampón de glicina-NaOH ajustado a pH 10,5 de 1,0 M.
- Prepare una curva estándar de 4-metilumbeliferona (4-MU) a partir de un stock de 0,01 mg/mL de la siguiente manera:
100 μL H2O/ no 4-MU; 80 μL H2O/ 20 μL 4-MU; 60 μL H2O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H2O/ 60 μL 4-MU; 20 μL H2O/ 80 μL 4-MU; no H2O/ 100 μL 4-MU, pipetear 10 μL de cada dilución en la placa de 96 pocillos (por duplicado) y añadir 200 μL del tampón de glicina-NaOH 1,0 M a cada pocillo para ajustar el volumen y el pH.
- Mida la actividad enzimática en un lector de fluorescencia equipado con el conjunto de filtros adecuado y analice los datos utilizando el software adecuado para el dispositivo lector de fluorescencia.
nota: Ambos sustratos de 4-MUG se reducen a 4-MU durante la exposición a la α-galactosidasa A o al ácido α-glucosidasa. El 4-MU liberado es un fluorocromo, que se puede medir a 360 y 465 nm como longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente, utilizando un lector de fluorescencia de microplaca.
