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1. Ensayo de inactivación viral
Nota: En la Figura 1A se enumeran ejemplos de período de incubación y dosis viral para varios virus. Las concentraciones más altas del virus también se pueden probar aumentando el MOI/PFU.
- Siembre células Huh-7.5 en una placa de 96 pocillos (1 × 104 celdas por pocillo) e incube a 37 °C en una incubadora O/N de CO2 al 5% para obtener una monocapa.
- Incubar los compuestos problema o los controles (las concentraciones finales son: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) con las partículas del VHC a 37 °C (Figura 1A, 'A largo plazo') en una proporción de 1:1. Por ejemplo, a un inóculo viral de 100 μl que contenga 1 x 104 FFU, agregue 100 μl de una dilución de trabajo de CHLA de 100 μM; esto produce un tratamiento con CHLA a una concentración final de 50 μM.
- Diluir la mezcla de virus y fármaco hasta una concentración "subterapéutica" (ineficaz) de los compuestos de prueba. Por ejemplo, la concentración ineficaz de CHLA y PUG contra el VHC es de 1 μM31; por lo tanto, esto requiere una dilución de 50 veces de la mezcla virus-fármaco que se puede lograr con 9,8 ml de medio basal (medio de cultivo celular con 2% de FBS).
Nota: La dilución a concentración subterapéutica evita una interacción significativa entre los compuestos de prueba y la superficie de la célula huésped y permite examinar el efecto del tratamiento en los viriones libres de células. Obsérvese que esta dilución depende de la respuesta a la dosis antiviral de los compuestos de ensayo frente a la infección vírica concreta y se determina antes de realizar este ensayo concreto.
- A modo de comparación, mezcle el virus con los compuestos de ensayo y diluya inmediatamente (sin período de incubación) hasta una concentración subterapéutica antes de la infección (figura 1A, «A corto plazo»).
- Añadir 100 μl de la mezcla diluida de VHC-fármaco en la monocapa celular Huh-7.5 (la cantidad de virus es ahora de 1 x 102 FFU; MOI final = 0,01) e incubar durante 3 horas a 37 °C para permitir la adsorción viral.
- Después de la infección, retire los inóculos diluidos y lave suavemente los pocillos con 200 μl de PBS dos veces.
nota: Realice los lavados con suavidad para evitar levantar las células.
- Aplicar 100 μl de medio basal en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 72 horas.
- Analice la infección resultante mediante el análisis de la actividad de la luciferasa en el sobrenadante.
