Evaluación de la eficacia de un compuesto de prueba antiviral a través de un ensayo de inactivación viral

1. Ensayo de inactivación viral

Nota: En la Figura 1A se enumeran ejemplos de período de incubación y dosis viral para varios virus. Las concentraciones más altas del virus también se pueden probar aumentando el MOI/PFU.

1. Siembre células Huh-7.5 en una placa de 96 pocillos (1 × 10⁴ celdas por pocillo) e incube a 37 °C en una incubadora O/N de CO₂ al 5% para obtener una monocapa.
2. Incubar los compuestos problema o los controles (las concentraciones finales son: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) con las partículas del VHC a 37 °C (Figura 1A, 'A largo plazo') en una proporción de 1:1. Por ejemplo, a un inóculo viral de 100 μl que contenga 1 x 104 FFU, agregue 100 μl de una dilución de trabajo de CHLA de 100 μM; esto produce un tratamiento con CHLA a una concentración final de 50 μM.
3. Diluir la mezcla de virus y fármaco hasta una concentración "subterapéutica" (ineficaz) de los compuestos de prueba. Por ejemplo, la concentración ineficaz de CHLA y PUG contra el VHC es de 1 μM31; por lo tanto, esto requiere una dilución de 50 veces de la mezcla virus-fármaco que se puede lograr con 9,8 ml de medio basal (medio de cultivo celular con 2% de FBS).
   Nota: La dilución a concentración subterapéutica evita una interacción significativa entre los compuestos de prueba y la superficie de la célula huésped y permite examinar el efecto del tratamiento en los viriones libres de células. Obsérvese que esta dilución depende de la respuesta a la dosis antiviral de los compuestos de ensayo frente a la infección vírica concreta y se determina antes de realizar este ensayo concreto.
4. A modo de comparación, mezcle el virus con los compuestos de ensayo y diluya inmediatamente (sin período de incubación) hasta una concentración subterapéutica antes de la infección (figura 1A, «A corto plazo»).
5. Añadir 100 μl de la mezcla diluida de VHC-fármaco en la monocapa celular Huh-7.5 (la cantidad de virus es ahora de 1 x 10² FFU; MOI final = 0,01) e incubar durante 3 horas a 37 °C para permitir la adsorción viral.
6. Después de la infección, retire los inóculos diluidos y lave suavemente los pocillos con 200 μl de PBS dos veces.
   nota: Realice los lavados con suavidad para evitar levantar las células.
7. Aplicar 100 μl de medio basal en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 72 horas.
8. Analice la infección resultante mediante el análisis de la actividad de la luciferasa en el sobrenadante.

Figura 1. Inactivación de infecciones virales por los compuestos de prueba CHLA y PUG. Los diferentes virus se trataron con los compuestos de prueba durante un período prolongado (incubados durante 1,5 a 3 horas antes de la valoración; barras de color gris claro) o un período corto (diluidos inmediatamente; barras de color gris oscuro) a 37 °C antes de una dilución a concentración subterapéutica y el posterior análisis de la infección en las respectivas células huésped. (A) Esquemas del experimento (mostrados a la izquierda) con la concentración final del virus (PFU/pozo o MOI), el período de incubación a largo plazo virus-fármaco (i) y el tiempo de incubación posterior (ii) indicados para cada virus en la tabla de la derecha. Los análisis para (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV y (F) RSV se indican en cada panel adicional. Los resultados se trazan contra el tratamiento de control negativo DMSO para la infección por virus y los datos mostrados son las medias ± los errores estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes. Esta figura ha sido modificada de la referencia.