>Nota: Asegúrese de que todos los procedimientos que impliquen cultivo celular e infección viral se lleven a cabo en campanas de bioseguridad certificadas que sean apropiadas para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manipulan. Con el fin de describir los protocolos, se utiliza el VHC marcado con Gaussia luciferasa como virus modelo. En el contexto de los resultados representativos, los compuestos ácido quebulágico (CHLA) y punicalagina (PUG) se utilizan como antivirales candidatos que se dirigen a las interacciones de las glicoproteínas virales con los glicosaminoglicanos de la superficie celular durante las primeras etapas de entrada viral. La heparina, que se sabe que interfiere con la entrada de muchos virus, se utiliza como tratamiento de control positivo en este contexto.
>1. Cultivo celular, preparación de compuestos y citotoxicidad de compuestos
- Cultivar la línea celular respectiva para el sistema de infección viral que se va a analizar (Tabla 1). Para el VHC, cultive las células Huh-7.5 en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 200 U/ml de penicilina G, 200 μg/ml de estreptomicina y 0,5 μg/ml de anfotericina B.
- Preparar los compuestos problema y los controles utilizando sus respectivos disolventes: por ejemplo, disolver CHLA y PUG en dimetilsulfóxido (DMSO); preparar heparina en agua estéril de doble destilación. Para todas las diluciones posteriores, utilice medios de cultivo.
Nota: La concentración final de DMSO en los tratamientos con compuestos de prueba es inferior al 1% en los experimentos; El 1% de DMSO se incluye como tratamiento de control negativo en los ensayos para la comparación.
- Determinar la citotoxicidad de los compuestos de ensayo (por ejemplo, CHLA y PUG) en las células para la infección viral utilizando un reactivo determinante de la viabilidad celular como XTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-5-fenilamino)-carbonilo]-2H-hidróxido de tetrazolio):
- Para el VHC, siembre células Huh-7.5 en una placa de 96 pocillos (1 × 104 celdas por pocillo) e incube a 37 °C en una incubadora O/N de CO2 al 5% para obtener una monocapa.
- Aplique el control de DMSO (1%) o concentraciones crecientes de los compuestos de prueba CHLA y PUG (por ejemplo, 0, 10, 50, 100 y 500 μM) a los pocillos de cultivo por triplicado.
- Incubar a 37 °C durante 72 horas, desechar el medio en la placa y lavar las células con 200 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces.
- Añada 100 μl de solución de ensayo del kit de ensayo de toxicología in vitro basado en XTT a cada pocillo e incube las placas a 37 °C durante otras 3 horas para permitir la producción de formazano XTT.
- Determine la absorbancia con un lector de microplacas a una longitud de onda de prueba de 492 nm y una longitud de onda de referencia de 690 nm.
- Calcule el porcentaje de células supervivientes utilizando la siguiente fórmula: viabilidad de la célula (%) = At / As × 100%, donde 'At' y 'As' se refieren a la absorbancia de los compuestos de ensayo y a los tratamientos de control con disolventes (por ejemplo, 1% de DMSO), respectivamente. Determinar la concentración de citotoxicidad celular del 50% (CC50) de los compuestos problema a partir de un software analítico como GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante.
>2. Lectura de la infección viral
>Nota: La lectura de la infección viral depende del sistema de virus utilizado y puede implicar métodos como ensayos de placa o medición de señales reporteras de virus marcados con reporteros. A continuación se describe el método para detectar la infección por el VHC reportero basado en la actividad reportera de la luciferasa.
- Recoja los sobrenadantes de los pocillos infectados y clarifique a 17.000 x g en una microcentrífuga durante 5 min a 4 °C.
- Mezcle 20 μl de sobrenadante de prueba con 50 μl de sustrato de luciferasa del kit de ensayo de luciferasa Gaussia y mida directamente con un luminómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Exprese la infectividad del VHC como log10 de las unidades de luz relativa (RLU) para determinar la inhibición viral (%) y calcule la concentración efectiva del 50% (EC50) de los compuestos de prueba contra la infección por el VHC utilizando algoritmos del software GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante.
>3. Ensayo de Entrada/Fusión Viral
>Nota: En la Figura 1A se enumeran ejemplos de períodos de incubación y dosis virales para varios virus en la Figura 1A 'Entrada/Fusión'. Las concentraciones más altas del virus también se pueden probar aumentando el MOI/PFU.
- Siembre células Huh-7.5 en una placa de 96 pocillos (1 × 104 celdas por pocillo) e incube a 37 °C en una incubadora O/N de CO2 al 5% para obtener una monocapa.
- Enfriar previamente las monocapas celulares en placas a 4 °C durante 1 hora.
- Infectar las células con VHC (multiplicidad de infección, MOI = 0,01) a 4 °C durante 3 horas. Por ejemplo, utilice un inóculo viral de 100 μl que contenga 1 x 102 unidades formadoras de foco (FFU).
nota: Realizar la adición del inóculo viral en hielo y la posterior incubación en un refrigerador a 4 °C para mantener la temperatura a 4 °C, lo que permite la unión viral pero no la entrada.
- Retire el sobrenadante y lave suavemente las monocapas celulares con 200 μl de PBS helado dos veces.
nota: Realice los lavados con suavidad para evitar levantar las células.
- Tratar los pocillos con los compuestos problema o controles (las concentraciones finales son: CHLA = 50 μM; PUG = 50 μM; heparina = 1.000 μg/ml; DMSO = 1%) e incubar a 37 °C durante 3 horas. Por ejemplo, agregue 10 μl de una dilución de trabajo de CHLA de 500 μM a 90 μl de medio, mezcle y trate los pocillos; esto produce el tratamiento con CHLA a una concentración final de 50 μM.
nota: El cambio de 4 °C a 37 °C ahora facilita el evento de entrada/fusión viral y, por lo tanto, permite evaluar el efecto de los compuestos de prueba en este paso en particular.
- Aspire el sobrenadante que contiene el fármaco y elimine los virus extracelulares no internalizados lavándolos con 200 μl de tampón de citrato (50 mM de citrato de sodio, 4 mM de cloruro de potasio, pH 3,0) o PBS. Aplicar 100 μl del medio basal antes de incubar a 37 °C durante 72 horas.
- Analice la infección resultante mediante el análisis del sobrenadante para determinar la actividad de la luciferasa como se describe en '2. Lectura de la infección viral'.
