Detección colorimétrica de un biomarcador bacteriano mediante una prueba de tornasol modificada

Resumen

Fuente: Tram, K., et al. Detección colorimétrica de bacterias mediante prueba de tornasol. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra un método colorimétrico de detección de E. coli, que involucra un biomarcador de E. coli que activa una DNAzyme, lo que lleva a la escisión del enlace de ARN y al desprendimiento de un conjugado DNAzyme-ureasa. Un ensayo colorimétrico posterior detecta el biomarcador de E. coli a través de los cambios de pH inducidos por el amoníaco.

Protocolo

1. Preparación de células de E. coli para la prueba

1. Para obtener la suspensión celular deseada, transfiera 1 ml de material cultivado a un tubo de microfuga de 1,5 ml.
2. Centrifugar las células a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar la pellet.
3. Agregue 10 μl de tampón de reacción al pellet de celdas y vuelva a suspender las celdas. Sonicar la suspensión celular durante 5 min. Transfiera la suspensión de la celda a una caja de hielo durante 5 minutos.
4. Sonicar la suspensión celular durante otros 5 min.
5. Centrifugar la suspensión celular a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C. Utilice el sobrenadante para la prueba (10 μl).

>2. Prueba de fuego

1. En un tubo de microfuga de 1,5 ml, prelave el tubo añadiendo y vertiendo en vórtice 100 μl de tampón de reacción (RB) en el tubo de microfuga y desechando el tampón.
2. Transfiera 15 μl de EC1 ensamblado al tubo de microfuga lavado.
3. Lave las perlas magnéticas colocando el tubo de microfuga en una rejilla magnética. Retire el sobrenadante mediante pipeteo. Retire el tubo de microfuga de la rejilla, agregue 100 μl de RB y vuelva a suspender con cuidado las perlas magnéticas.
4. Lave el MB dos veces más repitiendo el paso 2.3.
5. Vuelva a colocar el tubo de microfuga en la rejilla magnética, retire el sobrenadante y agregue la muestra de E. coli de 10 μl preparada en el paso 1.3.
6. Mezcle la muestra y las perlas magnéticas con cuidado golpeando suavemente el tubo de microfuga.
7. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora.
8. A la reacción, agregue 90 μl de ddH₂O y coloque el tubo de microfuga en una rejilla magnética.
9. Después de aproximadamente 3 minutos de separación magnética, transfiera cuidadosamente 85 μl del sobrenadante a un tubo de microfuga de 0,5 ml. Retire el sobrenadante lentamente para evitar que se recojan perlas magnéticas.
10. Al tubo de microfuga anterior se añadan 15 μl de rojo fenol al 0,04% y 100 μl de solución de sustrato.
11. Tome una fotografía a intervalos de tiempo específicos para registrar el cambio de color.
    nota: El cambio en el pH también se puede monitorear usando un medidor de pH con un microelectrodo. El pH inicial debe ser de aproximadamente 5,2-5,5 (la solución es amarilla). De lo contrario, la solución se puede ajustar mediante la adición de 1 mM de tampón de acetato pH 5.0).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	VWR AMRESCO	Artículo 105
Pellets de hidróxido de sodio (NaOH)	BIO BASIC CANADÁ INC	SB6789
Tris-base	VWR AMRESCO	497
urea	VWR AMRESCO	M123
Xilenecianol FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
0.04% Rojo fenol	SIGMA-ALDRICH	P3532
10x Tampón de reacción de polinucleótidos quinasas T4	Lucigen	30061-1
E. coli K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
Cuenta magnética (BioMag)	Laboratorios Bangs Inc
Bastidor de separación magnética	BioLabs de Nueva Inglaterra	S1506S
Tubos de microfuga	Sarstedt	72.69
Incubadora de cultivos celulares	Eppendorf Científico	M13520000
Limpiador ultrasónico Branson	Branson	N/A