>1. Transfectar ARNm a células
- Siembre las células HeLa en una placa de 24 pocillos (para que tengan aproximadamente ~80-90% de confluentez al día siguiente) e incube durante la noche en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
- Infectar células HeLa con el virus vaccinia (VACV) a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 o mantener células HeLa no infectadas para comparar.
nota: El MOI es el número de partículas virales infecciosas por célula.
- MOI de X= {[(Número de células * X) / Título de virus] * 1000} μl de virus por medio de 1 mL.
- Después de la h deseada después de la infección (hpi) (en este experimento a 10-12 hpi), transfecte el ARNm (500 ng de ARNm total por pocillo de placas de 24 pocillos) utilizando un reactivo de transfección de lípidos catiónicos como se muestra en la Figura 1C.
- Para un pocillo de una placa de 24 pocillos, mezcle 480 ng de ARNm de la secuencia 12A que contiene luciferasa de luciferasa de luciérnaga (12A-Fluc) y 20 ng de ARNm de la secuencia de Kozak que contiene Renilla luciferasa (Kozak-Rluc) en un tubo de microcentrífuga. En otro tubo de microcentrífuga, agregue 1,1 μL de reactivo de transfección de lípidos catiónicos.
- Añadir 55 μL de medio sérico reducido en ambos tubos. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Después de 5 minutos de incubación, agregue 55 μL de reactivo de transfección de lípidos catiónicos que contenga medio sérico reducido en un tubo que contenga ARNm.
- Mezcle suave pero bien e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Durante la incubación, retire el medio de cultivo celular y agregue 400 μL de medio sérico reducido por pocillo de placas de 24 pocillos.
- Después de la incubación, agregue 100 μL de la mezcla gota a gota y uniformemente a un pocillo de placas de 24 pocillos.
>2. Medir las actividades de la luciferasa
- Cinco horas después de la co-transfección del ARNm de 12A-Fluc y Kozak-Rluc, se mide la actividad de la luciferasa utilizando un sistema de ensayo de luciferasa capaz de realizar dos ensayos reporteros (p. ej., kit de ensayo Dual-Luciferase Reporter
).
- Retire el medio sérico reducido y lise las células añadiendo 150 μL de tampón de lisis 1x, un componente del kit de ensayo de luciferasa.
- Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, recoja el lisado raspando las células y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar el lisado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C para pellets de celda residual.
- Agregue 30 μL de sobrenadante en una placa de ensayo blanca de 96 pocillos de paredes opacas con un fondo sólido.
- Mida la luminiscencia dual utilizando el kit de ensayo de luciferasa y un luminómetro lector de placas multimodo.
- Realice la medición utilizando la función cinética (por pocillo) utilizando los ajustes descritos en la Tabla 1.
nota: La lectura también se puede tomar con un luminómetro manual. Agregue un volumen igual de lisado y sustrato para Fluc en una cubeta. Espere 2 s y mida 10 s con un luminómetro. Después de la medición de Fluc, saque rápidamente la cubeta del luminómetro y agregue un volumen igual del sustrato para Rluc manualmente. Nuevamente, espere 2 segundos y mida durante 10 segundos con un luminómetro.
- Exporte los datos de lectura de luminiscencia a un formato de archivo deseado.
- Determine la tasa de traducción relativa del ARNm de 12A-Fluc en células HeLa no infectadas e infectadas con VACV dividiendo el valor de Fluc por el valor de Rluc de control interno.
NOTA: La Figura 2 muestra el análisis paso a paso de los datos sin procesar para obtener la actividad relativa de Fluc.
Tabla 1: Ajustes de medición de luciferasa: los pasos para la medición de luciferasa con el volumen o tiempo recomendados.
| Pasos | Volumen/Tiempo |
| Inyecte sustrato de ensayo de luciferasa (Fluc): | 30 μL |
| Tiempo de espera / incubación: | 2 s |
| Medición de luminiscencia (fluc): | 10 s |
| Sustrato Stop & Glo (Rluc): | 30 μL |
| Tiempo de espera / incubación: | 2 s |
| Medición de luminiscencia (Rluc): | 10 s |
