Un método de microtitulación en placa para evaluar la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico

Resumen

Fuente: Ketelboeter, L. M., et al. Métodos para inhibir la producción bacteriana de piomelanina y determinar el aumento correspondiente de la sensibilidad al estrés oxidativo. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra un método basado en placas de microtitulación para determinar la Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) de antibióticos de prueba contra bacterias. Al añadir una suspensión del patógeno bacteriano Pseudomonas aeruginosa a una placa de microtitulación que contiene diluciones en serie de un antibiótico de prueba y un inhibidor de la producción de piomelanina por parte de las bacterias, se mide la densidad óptica de los pocillos para calcular la concentración inhibitoria mínima del antibiótico y el impacto del inhibidor de la producción de piomelanina en la sensibilidad antibiótica de las bacterias.

Protocolo

>1. Ensayo de Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) de Antibiótico en Placas de 96 Pocillos

1. Establecer cultivos nocturnos de las cepas que se van a probar en LB (Luria-Bertani) con y sin NTBC (2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona).
   nota: Este protocolo se describe utilizando el nivel representativo de 300 μM NTBC.
   1. Agregue 300 μM de NTBC a 2 ml de LB. Agregue un volumen equivalente de vehículo (dimetilsulfóxido, DMSO) a 2 ml de LB para la condición de no NTBC.
   2. Usando palillos de dientes estériles, inocule los tubos con una colonia aislada de bacterias. Habrá un cultivo con NTBC y un cultivo sin NTBC para cada cepa. Incubar durante la noche a 37 °C con aireación utilizando un rotador de cultivo de tejidos en una incubadora de aire.
2. Al día siguiente, elabore soluciones maestras LB + NTBC y LB + DMSO para configurar el ensayo MIC. Agregue NTBC a una concentración de 600 μM, ya que se diluirá dos veces cuando se agregue inóculo, lo que produce una concentración final de 300 μM.
   1. Para probar un antibiótico para una cepa, agregue 600 μM de NTBC a 2 ml de LB y mezcle para hacer la solución maestra de NTBC. Agregue un volumen equivalente de vehículo (DMSO) a 2 ml LB y mezcle para hacer la solución maestra sin NTBC. Utilice estas soluciones para crear soluciones madre de antibióticos, así como para configurar la serie de dilución en placas de 96 pocillos.
      nota: Las formulaciones de la solución maestra producirán soluciones adicionales para tener en cuenta los errores de pipeteo. Las soluciones maestras pueden ampliarse o reducirse según sea necesario en función del número de antibióticos y cepas analizadas.
3. Prepare las soluciones antibióticas en las soluciones maestras LB + NTBC o LB + DMSO.
   nota: La concentración de antibiótico en estas soluciones debe ser el doble de la concentración final deseada. Se debe producir suficiente solución para transferir 100 μl a cuatro pocillos en una placa de 96 pocillos.
   1. Preparar gentamicina +/- solución madre NTBC a 64 μg/ml. Para preparar esta solución, agregue 0,288 μl de caldo de gentamicina (100 mg/ml) a 450 μl de solución maestra LB + NTBC o LB + DMSO.
      NOTA: La concentración máxima de gentamicina para Pseudomonas aeruginosa PAO1 es de 32 μg/ml.
   2. Prepare la solución madre de kanamicina +/- NTBC a 256 μg/ml. Para hacer esta solución, agregue 3,84 μl de caldo de kanamicina (30 mg/ml) a 450 μl de soluciones maestras LB + NTBC o LB + DMSO.
      nota: La concentración máxima de kanamicina para P. aeruginosa PAO1 es de 128 μg/ml.
   3. Preparar solución madre de tobramicina +/- NTBC a 8 μg/ml. Para hacer esta solución, agregue 0,36 μl de caldo de tobramicina (10 mg/ml) a 450 μl de soluciones maestras LB + NTBC o LB + DMSO.
      nota: Para P. aeruginosa PAO1, la concentración máxima de tobramicina es de 4 μg/ml.
      nota: Los antibióticos y las concentraciones se pueden ajustar para las bacterias que se van a analizar.
4. Agregue 100 μl de cada solución antibiótica 2x a cuatro pocillos en una placa de 96 pocillos. Coloque estas soluciones en la fila A. Por ejemplo, la gentamicina debe colocarse en A1 a A4, la kanamicina debe colocarse en A5 a A8 y la tobramicina debe colocarse en A9 a A12. Consulte la Figura 1A para ver un diagrama de una configuración de placa de 96 pocillos.
   nota: Se pueden analizar varios antibióticos en una placa, pero solo se debe analizar una cepa por placa para eliminar la posibilidad de contaminación cruzada de otras cepas.
5. Agregue 50 μl de la solución maestra LB + NTBC o LB + DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que una placa sea LB + NTBC y una placa sea LB + DMSO. Véase la figura 1A.
   1. Use LB + NTBC para los antibióticos en LB + NTBC. Use LB + DMSO para los antibióticos en LB + DMSO.
6. Con una micropipeta, realice diluciones en serie dobles de los antibióticos transfiriendo 50 μl de la solución de la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambie las puntas de las pipetas y transfiera 50 μl de la solución de la fila B a la fila C. Repita para las filas restantes. Después de diluir la fila G, retire 50 μl de la solución de esa fila y deséchela. Use la fila H como un control sin antibióticos para el crecimiento bacteriano. Ver Figura 1B.
   NOTA: Cada pocillo en las filas de la A a la G ahora contiene 50 μl de antibiótico en LB + NTBC o LB + DMSO a 2 veces la concentración final deseada. La fila H contiene LB + NTBC o LB + DMSO sin antibióticos.
7. Mida el OD₆₀₀ de los cultivos durante la noche. Lave todos los cultivos antes de tomar lecturas de OD₆₀₀ para eliminar la piomelanina presente en los medios.
   1. Lavar los cultivos centrifugando 1 ml de cultivo en una microcentrífuga a 16.000 x g durante 2 min. Retirar el sobrenadante con una micropipeta y resuspender el pellet celular en 1 ml LB.
8. Diluir los cultivos durante la noche a 2,75x10⁵ UFC/ml en LB.
   nota: Supongamos que una unidad de_{DO 600} es el equivalente a 1x10⁹ UFC/ml para P. aeruginosa. Las conversiones de OD a UFC/ml pueden ser diferentes en otras bacterias.
9. Añadir 50 μl del cultivo bacteriano diluido en el pocillo adecuado.
   nota: Los cultivos cultivados en NTBC deben agregarse a los pocillos que contienen NTBC y los cultivos cultivados en DMSO deben agregarse a los pocillos que contienen DMSO. Véase la figura 1B.
   1. Agregue bacterias a tres pocillos para cada cepa y concentración de antibiótico. Agregue 50 μl de LB al cuarto pocillo para que actúe como control de la contaminación bacteriana. Véase la figura 1B.
   2. Utilice una micropipeta multicanal para inocular los pocillos. Asegúrese de que las puntas de las pipetas estén cerca del fondo de los pocillos cuando agregue inóculo para evitar la contaminación de los pozos vecinos><. nota: La adición de cultivo bacteriano a los pocillos diluirá las concentraciones de antibióticos y NTBC dos veces.
10. Cubra las placas de 96 pocillos con parafilm e incube durante aproximadamente 24 horas a 37 °C. Incube las placas de 96 pocillos estáticamente, en una incubadora de aire.
11. Examine las placas en busca de crecimiento bacteriano en los pocillos. La CMI es la concentración más baja de antibiótico en la que no se observa crecimiento bacteriano para las tres réplicas de cada cepa.
    1. Examine visualmente el crecimiento de la placa o léala con un lector de placas configurado en OD₆₀₀.

Resultados

Figura 1: Esquema de la configuración de la placa de 96 pocillos del ensayo MIC de antibióticos. (A) 100 μl de 2x antibióticos de la concentración inicial más alta están en la fila A. Las filas B a H se llenan con 50 μl de LB + NTBC o LB + DMSO sin antibióticos. (B) Se realizan diluciones en serie dobles en las filas A a G, lo que da como resultado 5...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50 mg	También se llama nitisinona. Soluble en DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 % en peso en H2O. Estabilizado.
gentamicina	Biografía de oro	G-400-100	Soluble enH2O. Filtro esterilizante.
kanamicina	Fisher Científico	BP906-5	Soluble enH2O. Filtro esterilizante.
Tobramicina	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble enH2O. Filtro esterilizante.