1. Fabricación de hidrogeles finos de poliacrilamida (PA) de dos capas en placas de pocillos múltiples
- Fabricación de hidrogel de poliacrilamida
nota: Véase la figura 1.
- Prepare soluciones acuosas que contengan 3 - 10% de 40% de solución de acrilamida (ver Tabla de Materiales) y 0.06 - 0.6% de solución de bis-acrilamida 2% (ver Tabla de Materiales) para fabricar hidrogeles de rigidez ajustable que van desde 0.6 kPa a 70 kPa. Ver Tabla 1.
- Para hidrogeles de 0,6 kPa, mezcle un 3% de acrilamida con un 0,045% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 3 kPa, mezcle un 5% de acrilamida con un 0,074% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 10 kPa, mezcle un 10% de acrilamida con un 0,075% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 20 kPa, mezcle un 8% de acrilamida con un 0,195% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 70 kPa, mezclar 10% de acrilamida con 0,45% de bis-acrilamida.
NOTA: Puede encontrar más detalles sobre cómo lograr la rigidez deseable del hidrogel PA en otro lugar.
- Prepare dos soluciones acuosas para cada rigidez de hidrogel deseable. Prepare la Solución 1 para que no tenga perlas y la Solución 2 para que contenga microperlas fluorescentes de 0,03% y 0,1 μm de diámetro (consulte la Tabla de materiales).
- Desgasifique las soluciones 1 y 2 al vacío durante 15 min para eliminar el oxígeno que se sabe que inhibe la polimerización de las soluciones.
- Añada el 0,6% de la solución madre de APS de 10 g/mL y el 0,43% de tetrametiletilendiamina (TEMED) a la solución 1 para permitir el inicio de la polimerización. Actúe rápido.
- Agregue 3.6 μL de Solución 1 al centro de cada pocillo del plato de 24 pocillos.
- Cubra inmediatamente los pocillos con cubreobjetos circulares sin tratar de 12 mm y deje reposar la Solución 1 durante 20 minutos para que polimerice completamente.
- Golpee suavemente la superficie con la aguja de una jeringa para crear un pequeño gancho en su punta para facilitar la extracción de los cubreobjetos. Levante los cubreobjetos con la aguja de la jeringa.
- Añada 0,6 % de la solución APS de 10 g/ml y 0,43 % de TEMED a la solución 2. Deposite 2,4 μL de la mezcla encima de la primera capa en cada pocillo del plato de 24 pocillos.
- Cubra la Solución 2 con cubreobjetos de vidrio circulares de 12 mm, presionando suavemente hacia abajo con un par de pinzas para garantizar que el grosor de la segunda capa sea mínimo. Deje que la solución 2 polimerice durante 20 min.
- Añadir 500 μL de 50 mM HEPES pH 7,5 a cada uno de los pocillos y, a continuación, retirar los cubreobjetos de vidrio con la aguja de la jeringa y las pinzas.
- Esterilización, recubrimiento de colágeno y equilibrio de hidrogeles de poliacrilamida
- Exponga los hidrogeles a los rayos UV durante 1 h en la campana de cultivo de tejidos para permitir la esterilización.
- Prepare una mezcla de 0,5% peso/volumen de sulfosuccinimidil 6-(4′-azido-2′-nitrofenilamino)hexanoato (Sulfo-SANPAH, ver Tabla de Materiales) en DMSO al 1% y 50 mM HEPES pH = 7,5.
- Añadir 200 μL de esta solución a la superficie superior de los hidrogeles. Actuando rápidamente, expóngalos a los rayos UV (302 nm) durante 10 minutos para activarlos.
- Lavar los hidrogeles dos veces con 1 mL de 50 mM HEPES pH = 7,5. Repita si es necesario para asegurarse de que se elimine el exceso de reticulante.
- Recubrir los hidrogeles con 200 μL de 0,25 mg/mL de colágeno I de cola de rata (ver Tabla de Materiales) en 50 mM de HEPES. Incubar los hidrogeles, con la solución de colágeno encima, durante la noche a temperatura ambiente.
nota: Para evitar la deshidratación/evaporación, coloque las placas de pocillos múltiples en una contención secundaria y agregue pañuelos de limpieza de laboratorio empapados en agua en la periferia interna de la contención.
- Utilice un microscopio de epifluorescencia o confocal con un objetivo de 40X para medir el grosor de los hidrogeles. Para ello, ubique las posiciones z de los planos inferior (donde está la superficie del vidrio) y superior del hidrogel (donde la intensidad de las perlas fluorescentes es máxima). A continuación, resta las posiciones z para determinar la altura.
nota: Utilizamos un microscopio de epifluorescencia invertida y un objetivo de 40X con apertura numérica de 0,65 para medir el espesor de los hidrogeles. Las mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM) también se pueden realizar en este punto para confirmar la rigidez exacta de los hidrogeles (ver Figura 2).
- Antes de sembrar las células de interés en los hidrogeles, agregue 1 mL de medio en los hidrogeles e incube a 37 °C durante 30 min >a 1 h para asegurar el equilibrio<.
nota: Agregamos el medio completo MCDB-131 porque ese es el medio en el que se cultivaron las células huésped modelo (HMEC-1) (consulte el paso 2.1 para obtener más detalles).
>2. Cultivo y siembra de células endoteliales microvasculares humanas en hidrogeles
- Cultivo de células HMEC-1 (endotelial microvascular humana) en medio completo MCDB-131 que contiene medios MCDB-131 suplementados con suero fetal bovino al 10%, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 1 μg/mL de hidrocortisona y 2 mM de L-glutamina (ver Tabla de Materiales).
- Divida los cultivos confluentes 1:6 cada 3 a 4 días y mantenga las células hasta el paso 40.
- Un día antes del experimento, separe las células de su recipiente de cultivo utilizando tripsina/EDTA al 0,25%. Lavar primero las células y su recipiente de cultivo 1 vez con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y, a continuación, añadir la cantidad adecuada de tripsina/EDTA al 0,25% (2 mL por plato de 100 mm o matraz de 75 cm, 1 mL por plato de 60 mm o matraz de 25 cm), incubando el matraz a 37 °C durante 5 - 10 min para permitir el desprendimiento de las células de su sustrato.
- Neutralice la tripsina agregando el volumen deseado de medio completo MCDB-131, pipetee suavemente para romper los grupos de células y luego coloque la solución en un tubo de centrífuga cónico.
- Agite suavemente la solución de células para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente y luego saque 20 μL de la solución y llene muy suavemente las dos cámaras debajo del cubreobjetos de un hemocitómetro de vidrio.
- Granular la solución de las células contenidas en el tubo de centrífuga cónico mediante centrifugación durante 10 min a 500 x g.
- Durante el período de espera de 10 minutos, cuente las células con un hemocitómetro. Use un microscopio, concéntrese en las líneas de la cuadrícula del hemocitómetro con un objetivo 10X y luego use un contador manual para contar el número de células en un cuadrado de 1 mm x 1 mm.
- Mueva el hemocitómetro a otro cuadrado de 1 mm x 1 mm, cuente las células allí y luego repita el proceso dos veces más. Calcule el promedio de las cuatro mediciones y luego multiplique el promedio por 104. El valor final es el número de células viables/mL en la suspensión celular que se está centrifugando.
- Retire el líquido del tubo de centrífuga cónico mientras se asegura de que el pellet de la celda no se interrumpa. Vuelva a suspender las células en el medio completo MCDB-131 a una concentración de 4 x 105 células/mL.
- Siembre las células en suspensión en los hidrogeles retirando primero el medio con el que se incubaron los hidrogeles y luego agregando 1 mL de suspensión celular en cada hidrogel.
>3. Infección de células endoteliales microvasculares humanas con L. monocytogenes
- Tres días antes de la infección, extraiga la cepa de Lm que se va a utilizar de un caldo de glicerol (almacenado a -80 °C) en una placa de agar BHI que contenga 7,5 μg/mL de cloranfenicol y 200 μg/mL de estreptomicina, si procede.
nota: La cepa que se va a rayar puede ser de tipo salvaje o mutante, que exprese constitucionalmente fluorescencia (para la inmunotinción JAT1045 se utilizó) o que exprese fluorescencia bajo el promotor ActA (para citometría de flujo o microscopía de fuerza de tracción se utilizaron JAT983 o JAT985).
- Incubar las placas a 37 °C hasta que se formen colonias discretas (1 - 2 días).
- El día antes de la infección, cultivar la cepa deseada durante la noche, agitándola a 150 rpm a 30 °C en medios BHI con 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si procede).
- Coloque 5 mL de medio BHI en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL, agregue 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si corresponde) y luego inocule una sola colonia de la placa de agar con una punta estéril de 10 μL.
- Al día siguiente, justo antes de la infección, mida la densidad óptica de la solución bacteriana a 600 nm (OD600) diluyendo la muestra 1:5; use una cubeta que contenga BHI solo para que sirva como blanco.
- Diluir el cultivo durante la noche hasta una OD600 de 0,1 e incubarlo, agitando durante 2 h a 30 °C, en medio BHI con 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si procede) para permitir que las bacterias alcancen el crecimiento en fase logarítmica.
- Mida el OD600 de la solución bacteriana, que se espera que sea de alrededor de 0,2 a 0,3. Si el OD600 es más alto, dilúyalo a 0,2 - 0,3 solo con BHI.
- Tome 1 mL de solución bacteriana en un tubo de microcentrífuga. Gírelo durante 4 minutos a 2.000 x g mediante centrifugación a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet bacteriano en 1 mL de PBS apto para cultivo de tejidos, en la campana de cultivo de tejidos. Lave las bacterias dos veces más girándolas durante 4 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las bacterias en 1 mL de PBS.
- Prepare la mezcla de infección mezclando 10 o 50 μL de las bacterias resuspendidas en PBS con 1 mL de MCDB-131 medio completo para una multiplicidad de infecciones (MOI; es decir, el número de bacterias por célula huésped) de aproximadamente 50 bacterias por célula huésped o 10 bacterias por célula huésped.
- Retire los medios de los pocillos de las placas de 24 pocillos, con cuidado de no alterar los hidrogeles o las células. Lave las células 1 vez con 1 mL de MCDB-131 full media y luego agregue 1 mL de las bacterias a cada pocillo.
- Cubra el plato con su tapa y envuelva los platos con envoltura de polietileno para alimentos para evitar fugas. Coloque las placas en la centrífuga y centrifuga las muestras durante 10 minutos a 200 x g para sincronizar la invasión. Traslade las placas a la incubadora de cultivo de tejidos e incube durante 30 minutos a 37 °C.
- Lave las muestras 4 veces con MCDB-131 full media y muévalas a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de 30 minutos adicionales, sustituya el medio por un medio suplementado con 20 μg/ml de gentamicina.
>4. Citometría de flujo para cuantificar la rigidez de la matriz extracelular dependiente de la susceptibilidad de las células huésped a la infección
- Pesar 5 mg de colagenasa y colocarla en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml. Añadir 10 mL de tripsina-EDTA al 0,25% y mezclar bien.
- 8 h después de la infección, retire los medios de los pocillos de la placa de 24 pocillos y lave los pocillos 1 vez con PBS de cultivo de tejidos. Retire el PBS de los pocillos y agregue 200 μL de la mezcla de tripsina-EDTA/colagenasa a cada pocillo. Colóquelo en la incubadora de cultivo de tejidos durante 10 minutos para permitir el desprendimiento completo de las células.
- Utilice una pipeta nueva para cada pocillo y pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo 8 veces. Sea suave para no dañar las células. Agregue 200 μL de medio completo a cada pocillo para neutralizar la tripsina.
- Transfiera la solución de 400 μL de cada pocillo a un tubo de poliestireno de 5 mL con una tapa de filtro de células de 35 μm (consulte la Tabla de materiales).
- Analice de 10.000 a 20.000 células por muestra mediante citometría de flujo. Realice la adquisición de datos a través de citometría de flujo y determine el porcentaje de células infectadas por pocillo utilizando el software relevante disponible en el mercado. Utilice los diagramas de dispersión directa frente a dispersión lateral para controlar la mayor parte de la distribución de los recuentos de celdas.
NOTA: Esto asegurará el análisis de células individuales y eliminará los residuos o dobletes o tripletes de celdas.
- Mida la señal de fluorescencia de las células de control no infectadas y controle la población de células infectadas, excluyendo la autofluorescencia.
Tabla 1. Composición de los hidrogeles de poliacrilamida (PA) de diferente rigidez. En esta tabla, se indican en diferentes columnas el porcentaje de solución de acrilamida al 40% y el porcentaje de solución de bis-acrilamida al 2% para lograr una rigidez dada (módulo de Young, E).
| Módulo de Young (E, kPa) | Acrilamida % (desde 40% de stock) | Bisacrilamida % (desde 2% de stock) |
| 0.6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
