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1. Fabricación de hidrogeles finos de poliacrilamida (PA) de dos capas en placas de pocillos múltiples
- Disuelva el persulfato de amonio (APS) en agua ultrapura destilada para lograr una concentración final de 10 g/mL. Aliquot y almacene la solución a 4 °C para uso a corto plazo (3 semanas).
NOTA: La solución anterior se puede preparar antes de la fabricación del hidrogel.
- Activación de vidrio de platos de 24 pocillos
- Incubar placas de fondo de vidrio de 24 pocillos con pocillos de 13 mm de diámetro (ver Tabla de Materiales) durante 1 h con 500 μL de hidróxido de sodio (NaOH) 2 M por pocillo a temperatura ambiente.
- Enjuague los pocillos 1 vez con agua ultrapura y luego agregue 500 μL de trietoxisilano al 2% (3-aminopropilo) (consulte la Tabla de materiales) en etanol al 95% a cada pocillo durante 5 minutos.
- Enjuague los pocillos 1 vez con agua y agregue 500 μL de glutaraldehído al 0,5% a cada pocillo durante 30 min. Enjuague los pocillos 1 vez con agua y séquelos a 60 °C sin tapa.
- Fabricación de hidrogel de poliacrilamida
NOTA: Ver Figura 1.
- Prepare soluciones acuosas que contengan 3 - 10% de 40% de solución de acrilamida (ver Tabla de Materiales) y 0.06 - 0.6% de solución de bis-acrilamida 2% (ver Tabla de Materiales) para fabricar hidrogeles de rigidez ajustable que van desde 0.6 kPa a 70 kPa. Ver Tabla 1.
- Para hidrogeles de 0,6 kPa, mezcle un 3% de acrilamida con un 0,045% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 3 kPa, mezcle un 5% de acrilamida con un 0,074% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 10 kPa, mezcle un 10% de acrilamida con un 0,075% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 20 kPa, mezcle un 8% de acrilamida con un 0,195% de bis-acrilamida. Para hidrogeles de 70 kPa, mezcle un 10% de acrilamida con un 0,45% de bis-acrilamida.
NOTA: Puede encontrar más detalles sobre cómo lograr la rigidez deseable del hidrogel PA en otro lugar.
- Prepare dos soluciones acuosas para cada rigidez de hidrogel deseable. Prepare la Solución 1 para que no tenga perlas y la Solución 2 para que contenga microperlas fluorescentes de 0,03% y 0,1 μm de diámetro (consulte la Tabla de materiales).
- Desgasifique las soluciones 1 y 2 al vacío durante 15 min para eliminar el oxígeno que se sabe que inhibe la polimerización de las soluciones.
- Añada el 0,6% de la solución madre de APS de 10 g/mL y el 0,43% de tetrametiletilendiamina (TEMED) a la solución 1 para permitir el inicio de la polimerización. Actúe rápido.
- Agregue 3.6 μL de Solución 1 al centro de cada pocillo de la placa de 24 pocillos (consulte el paso 1.2 para su preparación).
- Cubra inmediatamente los pocillos con cubreobjetos circulares sin tratar de 12 mm y deje reposar la Solución 1 durante 20 minutos para que polimerice completamente.
- Golpee suavemente la superficie con la aguja de una jeringa para crear un pequeño gancho en su punta para facilitar la extracción de los cubreobjetos. Levante los cubreobjetos con la aguja de la jeringa.
- Añada 0,6 % de la solución APS de 10 g/ml y 0,43 % de TEMED a la solución 2. Deposite 2,4 μL de la mezcla encima de la primera capa en cada pocillo del plato de 24 pocillos.
- Cubra la Solución 2 con cubreobjetos de vidrio circulares de 12 mm, presionando suavemente hacia abajo con un par de pinzas para garantizar que el grosor de la segunda capa sea mínimo. Deje que la solución 2 polimerice durante 20 min.
- Añadir 500 μL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinesulfónico (HEPES) 50 mM de pH 7,5 a cada uno de los pocillos y luego retirar los cubreobjetos de vidrio con la aguja de la jeringa y las pinzas.
- Esterilización, recubrimiento de colágeno y equilibrio de hidrogeles de poliacrilamida
- Exponga los hidrogeles a los rayos UV durante 1 h en la campana de cultivo de tejidos para permitir la esterilización.
- Prepare una mezcla de sulfosuccinimidil 6-(4′-azido-2′-nitrofenilamino) hexanoato al 0,5% en peso/volumen (Sulfo-SANPAH, ver Tabla de Materiales) en 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 50 mM HEPES pH = 7,5.
- Añadir 200 μL de esta solución a la superficie superior de los hidrogeles. Actuando rápidamente, expóngalos a los rayos UV (302 nm) durante 10 minutos para activarlos.
- Lavar los hidrogeles dos veces con 1 mL de 50 mM HEPES pH = 7,5. Repita si es necesario para asegurarse de que se elimine el exceso de reticulante.
- Recubrir los hidrogeles con 200 μL de 0,25 mg/mL de colágeno I de cola de rata (ver Tabla de Materiales) en 50 mM de HEPES. Incubar los hidrogeles, con la solución de colágeno encima, durante la noche a temperatura ambiente.
NOTA: Para evitar la deshidratación/evaporación, coloque las placas de pocillos múltiples en una contención secundaria y agregue pañuelos de limpieza de laboratorio empapados en agua en la periferia interna de la contención.
- Utilice un microscopio de epifluorescencia o confocal con un objetivo de 40X para medir el grosor de los hidrogeles. Para ello, ubique las posiciones z de los planos inferior (donde está la superficie del vidrio) y superior del hidrogel (donde la intensidad de las perlas fluorescentes es máxima). A continuación, resta las posiciones z para determinar la altura.
NOTA: Utilizamos un microscopio de epifluorescencia invertida y un objetivo de 40X con apertura numérica de 0,65 para medir el espesor de los hidrogeles. Las mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM) también se pueden realizar en este punto para confirmar la rigidez exacta de los hidrogeles (ver Figura 2).
- Antes de sembrar las células de interés en los hidrogeles, agregue 1 mL de medio en los hidrogeles e incube a 37 °C durante 30 min >a 1 h para asegurar el equilibrio<.
NOTA: Agregamos el medio completo MCDB-131 porque ese es el medio en el que se cultivaron las células huésped modelo (HMEC-1) (consulte el paso 2.1 para obtener más detalles).
>2. Cultivo y siembra de células endoteliales microvasculares humanas en hidrogeles
- Cultivo de células HMEC-1 (endotelial microvascular humana) en medio completo MCDB-131 que contiene medios MCDB-131 suplementados con suero fetal bovino al 10%, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 1 μg/mL de hidrocortisona y 2 mM de L-glutamina (ver Tabla de Materiales).
- Dividir los cultivos confluentes 1:6 cada 3-4 días y conservar las celdas hasta el paso 40.
- Un día antes del experimento, separe las células de su recipiente de cultivo utilizando tripsina/EDTA al 0,25%. En primer lugar, lavar las células y su recipiente de cultivo 1x con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y, a continuación, añadir la cantidad adecuada de tripsina al 0,25 % (2 mL por plato de 100 mm o matraz de 75 cm, 1 mL por plato de 60 mm o matraz de 25 cm), incubando el matraz a 37 °C durante 5 - 10 min para permitir el desprendimiento de las células de su sustrato.
- Neutralice la tripsina agregando el volumen deseado de medio completo MCDB-131, pipetee suavemente para romper los grupos de células y luego coloque la solución en un tubo de centrífuga cónico.
- Agite suavemente la solución de células para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente y luego saque 20 μL de la solución y llene muy suavemente las dos cámaras debajo del cubreobjetos de un hemocitómetro de vidrio.
- Granular la solución de las células contenidas en el tubo de centrífuga cónico mediante centrifugación durante 10 min a 500 x g.
- Durante el período de espera de 10 minutos, cuente las células con un hemocitómetro. Use un microscopio, concéntrese en las líneas de la cuadrícula del hemocitómetro con un objetivo 10X y luego use un contador manual para contar el número de células en un cuadrado de 1 mm x 1 mm.
- Mueva el hemocitómetro a otro cuadrado de 1 mm x 1 mm, cuente las células allí y luego repita el proceso dos veces más. Calcule el promedio de las cuatro mediciones y luego multiplique el promedio por 104. El valor final es el número de células viables/mL en la suspensión celular que se está centrifugando.
- Retire el líquido del tubo de centrífuga cónico mientras se asegura de que el pellet de la celda no se interrumpa. Vuelva a suspender las células en el medio completo MCDB-131 a una concentración de 4 x 105 células/mL.
- Siembre las células en suspensión en los hidrogeles retirando primero el medio con el que se incubaron los hidrogeles y luego agregando 1 mL de suspensión celular en cada hidrogel.
>3. Infección de células endoteliales microvasculares humanas con Listeria monocytogenes (Lm)
- Preparación anticipada
NOTA: Prepare las siguientes soluciones con anticipación.
- Reservas de estreptomicina, cloranfenicol y gentamicina
- Preparar 50 mg/mL de soluciones madre de estreptomicina pesando 0,5 g de sulfato de estreptomicina y disolviéndolo completamente en 10 mL de agua ultrapura.
- Prepare 7,5 mg/mL de soluciones madre de cloranfenicol pesando 75 mg de cloranfenicol y disolviéndolo completamente en 10 mL de etanol al 100%.
- Prepare 20 mg/mL de soluciones madre de gentamicina pesando 0,2 g de sulfato de gentamicina y disolviéndolo completamente en 10 mL de agua ultrapura.
- Filtre-esterilice todas las soluciones madre con un filtro de jeringa de 0,2 μm y guárdelas a -20 °C para su uso a largo plazo (1 - 2 meses).
- Medios de infusión cerebro-corazón (BHI) y placas de agar
- Localice dos matraces de 1 litro y añada una barra de agitación magnética dentro de cada matraz.
- Para los medios BHI, añadir 37 g de polvo BHI en un matraz y añadir agua ultrapura hasta 1 L. Mezclar la solución enérgicamente colocando el matraz sobre una placa agitadora magnética hasta que el polvo se disuelva.
- Para las placas de agar BHI, añadir 37 g de polvo BHI y 15 g de agar granulado (ver Tabla de Materiales) en el segundo matraz y añadir agua ultrapura hasta 1 L. Mezclar la solución enérgicamente colocando el matraz en una placa de agitación magnética hasta que el polvo se disuelva.
- Atornille las tapas de los matraces no demasiado apretados y autoclave las soluciones utilizando el ajuste de líquido o de acuerdo con las especificaciones del autoclave.
- Retire la solución del autoclave y, a continuación, enfríe la solución de agar-BHI a 55 °C. Si el medio BHI en el matraz de 1 L se mantiene estéril, se puede utilizar hasta un mes.
- Para preparar las placas de agar-BHI para bacterias, primero agregue antibióticos, si corresponde, al matraz que contiene BHI y agar (dependiendo de las cepas bacterianas que se vayan a cultivar). Coloque brevemente el matraz en una placa de agitación magnética para permitir una mezcla rápida.
NOTA: Los antibióticos utilizados aquí son específicos para las cepas de Lm utilizadas, pero los antibióticos necesarios se pueden utilizar en placas de agar BHI. Añadimos estreptomicina a una concentración de 200 μg/mL y cloranfenicol a una concentración de 7,5 μg/mL porque las cepas de 10403S Lm son resistentes a la estreptomicina. Estas cepas se han conjugado con un plásmido que contiene el marco de lectura abierto de la cloranfenicol acetiltransferasa, de ahí la resistencia al cloranfenicol.
- Vierta la mezcla en placas de cultivo de bacterias de poliestireno de 10 cm (aproximadamente 20 ml por placa). Para deshacerse de las burbujas, flamee brevemente la superficie superior de las placas. Enfríe los platos durante la noche a temperatura ambiente.
- Al día siguiente, selle las placas secas y guárdelas a 4 °C.
- Infección de células endoteliales microvasculares humanas con L. monocytogenes
- Tres días antes de la infección, extraiga la cepa de Lm que se va a utilizar de un caldo de glicerol (almacenado a -80 °C) en una placa de agar BHI que contenga 7,5 μg/mL de cloranfenicol y 200 μg/mL de estreptomicina, si procede.
NOTA: La cepa que se va a rayar puede ser de tipo salvaje o mutante, que exprese constitucionalmente fluorescencia (para la inmunotinción JAT1045 se utilizó) o que exprese fluorescencia bajo el promotor ActA (para citometría de flujo o microscopía de fuerza de tracción se utilizaron JAT983 o JAT985).
- Incubar las placas a 37 °C hasta que se formen colonias discretas (1 - 2 días).
- El día antes de la infección, cultivar la cepa deseada durante la noche, agitándola a 150 rpm a 30 °C en medios BHI con 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si procede).
- Coloque 5 mL de medio BHI en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL, agregue 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si corresponde) y luego inocule una sola colonia de la placa de agar con una punta estéril de 10 μL.
- Al día siguiente, justo antes de la infección, mida la densidad óptica de la solución bacteriana a 600 nm (OD600) diluyendo la muestra 1:5; use una cubeta que contenga BHI solo para que sirva como blanco.
- Diluir el cultivo durante la noche hasta una OD600 de 0,1 e incubarlo, agitando durante 2 h a 30 °C, en medio BHI con 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si procede) para permitir que las bacterias alcancen el crecimiento en fase logarítmica.
- Mida el OD600 de la solución bacteriana, que se espera que sea de alrededor de 0,2-0,3. Si el OD600 es más alto, dilúyalo a 0,2 - 0,3 solo con BHI.
- Tome 1 mL de solución bacteriana en un tubo de microcentrífuga. Gírelo durante 4 minutos a 2.000 x g mediante centrifugación a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet bacteriano en 1 mL de PBS apto para cultivo de tejidos, en la campana de cultivo de tejidos. Lave las bacterias dos veces más girándolas durante 4 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las bacterias en 1 mL de PBS.
- Prepare la mezcla de infección mezclando 10 o 50 μL de las bacterias resuspendidas en PBS con 1 mL de MCDB-131 medio completo para una multiplicidad de infecciones (MOI; es decir, el número de bacterias por célula huésped) de aproximadamente 50 bacterias por célula huésped o 10 bacterias por célula huésped.
- Retire los medios de los pocillos de las placas de 24 pocillos, con cuidado de no alterar los hidrogeles o las células. Lave las células 1 vez con 1 mL de MCDB-131 full media y luego agregue 1 mL de las bacterias a cada pocillo.
- Conserve un poco de mezcla de infección (al menos 100 μL) para la determinación del MOI (ver paso 3.3).
- Cubra el plato con su tapa y envuelva los platos con envoltura de polietileno para alimentos para evitar fugas. Coloque las placas en la centrífuga y centrifuga las muestras durante 10 minutos a 200 x g para sincronizar la invasión. Traslade las placas a la incubadora de cultivo de tejidos e incube durante 30 minutos a 37 °C.
- Lave las muestras 4 veces con MCDB-131 full media y muévalas a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de 30 minutos adicionales, sustituya el medio por un medio suplementado con 20 μg/ml de gentamicina.
- Determinación de la multiplicidad de infecciones (MOI)
- Durante la incubación inicial de 30 minutos de las células huésped con las bacterias, prepare diluciones en serie de 10 veces de la mezcla de infección para determinar el MOI. Realice diluciones 10 veces mezclando 100 μL de la mezcla de infección con 900 μL de 1x PBS (dilución 10-1). A continuación, mezcle 100 μL de la dilución 10-1 con 900 μL de PBS (dilución 10-2).
- Continuar hasta obtener una dilución de 10-5.
NOTA: Todas las soluciones deben mezclarse bien antes de diluirlas, y se deben utilizar puntas de pipeta frescas y limpias en cada paso.
- Una vez realizadas las diluciones, colocar 100 μL de las diluciones 10-2 - 10-5 en el centro de las placas de BHI/agar/cloranfenicol/estreptomicina (si procede).
- Haga un esparcidor con una pipeta de vidrio usando fuego para doblar la pipeta y crear un gancho. Sumerja la pipeta en etanol al 100% para su esterilización y, a continuación, queme el etanol con una llama.
- Una vez que el esparcidor se haya enfriado, distribuya las diluciones bacterianas de manera homogénea en las placas comenzando desde la dilución 10-5 y pasando a las mezclas más concentradas. Incubar las placas boca abajo a 37 °C durante 2 días.
- Dependiendo de la densidad de colonias, determine el número de colonias de las placas de dilución 10-3 y 10-4 o 10-4 y 10-5. Calcule el MOI de la siguiente manera:
número de colonias × factor de dilución ÷ volumen añadido inicialmente = número de unidades formadoras de colonias (UFC) por μL
número de UFC por μL × volumen de mezcla de bacterias por pocillo = número de UFC por pocillo
número de UFC por pocillo × volumen de células por pocillo = número de bacterias por célula
NOTA: CFU significa unidades formadoras de colonias.
- Promedie los MOI de dos placas para obtener los MOI finales.
>4. Microscopía cuantitativa de lapso de tiempo para evaluar la rigidez de la matriz extracelular
Prepare los hidrogeles PA en una placa de 24 pocillos (consulte el paso 1), siembre células HMEC-1 (consulte el paso 2) y cultive cultivos JAT983 durante la noche como se describe anteriormente (consulte el paso 3).
- El día de la infección, prepare la mezcla de infección mezclando 10 μL de gránulo bacteriano por mL de MCDB-131 medio completo. Retire con cuidado los medios de los pocillos de las placas de 24 pocillos y agregue 1.9 mL del medio completo MCDB-131 y 0.1 mL de la mezcla bacteriana a cada pocillo.
NOTA: El MOI más bajo utilizado en este ensayo es necesario para analizar los eventos de diseminación que comienzan con una sola bacteria que invade una célula huésped.
- Cubra el plato con su tapa y séllelo con una envoltura de plástico para evitar fugas. Coloque las placas en la centrífuga y centrifuga las muestras durante 10 minutos a 200 x g para sincronizar la invasión.
- Mueva las placas a la incubadora de cultivo de tejidos e incube durante 5 minutos.
- Lave las muestras 4 veces con medios y muévalas a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de 5 a 7 minutos adicionales, reemplace el medio con medio suplementado con 20 μg/mL de gentamicina.
- Incube la placa en la incubadora durante 5 horas adicionales para permitir que el promotor actA se encienda e impulse la expresión del marco de lectura abierto mTagRFP.
- Prepare un medio de microscopía en vivo complementando L-15 de Leibovitz con 10% de suero fetal bovino, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico y 1 μg/mL de hidrocortisona.
NOTA: El L-15 ya contiene 2 mM de L-glutamina, por lo que no es necesario añadir extra como en el caso del medio MCDB-131.
- Mezcle 1 μL de 1 mg/mL de colorante Hoechst con 1 mL de L-15 de medio completo y agréguelo a cada pocillo para teñir los núcleos de las células. Coloque las células en la incubadora de cultivo de tejidos durante 10 min y luego reemplace en cada pocillo el medio completo L-15 con 1 mL de medio completo L-15 suplementado con 20 μg/mL de gentamicina. Cubra la placa con su tapa y colóquela en la cámara ambiental de un microscopio (ver Tabla de Materiales) equilibrada a 37 °C.
NOTA: Para la obtención de imágenes, se utilizó un microscopio de epifluorescencia invertida con una cámara CCD (ver Tabla de Materiales) y un objetivo de aire de fluorita de plano de aire 20X con 0,75 NA. La potencia se ajustó al 50% y el tiempo de exposición a 50 ms. Los filtros de microscopio utilizados para mCherry son de 470/525 nm para excitación y emisión respectivamente.
- Visualice múltiples posiciones cada 5 minutos utilizando una función de enfoque automático para monitorear cómo se propaga Lm a través de monocapas HMEC-1 sembradas en hidrogeles de diferente rigidez.
NOTA: L-15 está amortiguado con HEPES, por lo que no es necesario utilizar CO2 durante la toma de imágenes.
Tabla 1. Composición de los hidrogeles de poliacrilamida (PA) de diferente rigidez. En esta tabla, se indican en diferentes columnas el porcentaje de solución de acrilamida al 40% y el porcentaje de solución de bis-acrilamida al 2% para lograr una rigidez dada (módulo de Young, E).
| Módulo de Young (E, kPa) | Acrilamida % (desde 40% de stock) | Bisacrilamida % (desde 2% de stock) |
| 0.6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
