Determinación de la eficacia antiviral de fármacos experimentales mediante un ensayo de placa

Resumen

Fuente: Yadavalli, T., et al. Explante de tejido corneal porcino para estudiar la eficacia de los antivirales del virus del herpes simple-1. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra el método para realizar un ensayo de placa utilizando un virus obtenido de córnea porcina infectada. La córnea porcina se utiliza para probar la eficacia antiviral de fármacos experimentales.

Protocolo

1. Cuantificación de la infección viral

NOTA: Los títulos de virus de las córneas porcinas deben evaluarse todos los días para analizar el efecto del tratamiento farmacológico.

1. Para cuantificar el virus, siembre células Vero a una densidad de 5 x 10^{5 células} por pocillo si se utiliza una placa de 6 pocillos, como se hizo en este experimento. Hazlo un día antes de la infección. Incube las células plateadas durante la noche para asegurarse de que confluyan para la cuantificación del virus.
2. Alícuota 500 μL de medio sin suero en múltiples tubos de microcentrífuga. Inserte un hisopo estéril con punta de algodón sumergido en los tubos llenos de medios sin suero. Los bastoncillos de algodón deben sumergirse y humedecerse durante al menos 5 minutos antes de su uso.
3. Sin alterar los medios subyacentes, transporte la placa de córnea porcina infectada a un gabinete de bioseguridad. Con los bastoncillos de algodón húmedos, haga 3 revoluciones en el sentido de las agujas del reloj y 3 revoluciones en el sentido contrario a las agujas del reloj a un diámetro de 5 mm desde el centro de la córnea porcina infectada sin aplicar una presión excesiva.
4. Vuelva a insertar el hisopo de algodón en el tubo de microcentrífuga lleno de medios sin suero y gírelo 5 veces en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario. La punta metálica del hisopo de algodón debe cortarse para que quepa completamente en un tubo de microcentrífuga y la tapa pueda cerrarse.
5. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene la punta de algodón frotada en una máquina de vórtice y vórtice a alta velocidad durante 1 min.
6. Realizar la cuantificación del virus a través de un ensayo de placa en estas muestras.
   nota: Este paso de cuantificación debe realizarse en los días 2, 4 y, opcionalmente, 6 días después de la infección.

>2. Cuantificación de virus por ensayo de placa

NOTA: Para realizar un ensayo de placa, cultive y coloque células Vero en una placa de 6 pocillos y asegure una confluencia del 90% de las células antes del inicio del ensayo. Utilice un matraz confluente de 75^cm2 de estas celdas. Todos los pasos a continuación deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad.

1. Lave la monocapa confluente de células Vero en el matraz con 10 mL de solución salina tampón de fosfato fresco (PBS) después de aspirar el medio de cultivo. Repita el paso de lavado una vez más con PBS después de aspirar el primer conjunto de soluciones de lavado.
2. Añadir 1 mL de tripsina al 0,05% a la monocapa celular. Incubar el matraz a 37 °C durante 5 min. A simple vista, asegúrese de que las células se desprendan de la superficie interior del matraz. De lo contrario, espere otros 5 minutos antes de volver a examinar el matraz. Cuando las células parezcan estar desprendidas, añada 9 mL de medio entero a la monocapa para asegurarse de que las células se desprendan completamente de la superficie del matraz.
3. Recoja todas las células del matraz junto con todo el medio y colóquelas en un tubo de centrífuga de 15 ml.
4. Por cada pocillo de las 6 placas de pocillos que se utilizan para el ensayo de placa, utilice 300 μL del tubo de centrífuga. Rellene cada pocillo de la placa de 6 pocillos con 2 ml de medio entero. Deje las placas en la incubadora durante la noche para permitir que crezcan y formen una monocapa confluente en cada pocillo.
5. Para realizar un ensayo de placa, es necesario realizar una dilución en serie de las muestras antes de la cuantificación del virus.
6. Realice una dilución log101 veces del virus en tubos de microcentrífuga utilizando medios sin suero hasta alcanzar una dilución de ^10-8. Cuando en una dilución ^{de 10-3}, transfiera 1 mL de la dilución a la monocapa de células en placa después de aspirar el medio de crecimiento en las células de la placa de 6 pocillos, este será el paso de infección. Incubar la placa infectada a 37 °C durante 2 h.
7. Aspire el medio de infección existente, lave con PBS dos veces suavemente para recubrir las células y agregue 2 mL de medio cargado de metilcelulosa por pocillo a los 6 pocillos. Incubar durante 72 h o hasta que se vea la formación de placas. Las placas se pueden identificar por la formación de pequeños espacios entre las células en la monocapa celular.
8. Agregue 1 mL de metanol lentamente en la esquina de cada pocillo, usando la pared como punta guía. Incube la placa de 6 pocillos a temperatura ambiente durante 15 min. Aspire lentamente el contenido de cada pocillo de la placa sin alterar ni agitar la monocapa celular.
9. Agregue 1 ml de solución de trabajo de cristal violeta a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, asegurándose de que todas las células estén cubiertas. Incuba la placa de 6 pocillos en la oscuridad durante 30 min. Deseche la solución de violeta cristalina aspirándola y seque los pocillos en una hoja de papel absorbente.
10. Cuente el número de placas en el pozo de dilución más alto para cuantificar el contenido total de virus en la solución de partida. Repita el proceso dos veces para confirmar el título viral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agujas hipodérmicas de 30 G.	Bd	305128
Frasco de vidrio de 500 mL.	Thomas Científico	844027
Cabina de bioseguridad con certificación de bioseguridad de nivel 2 (BSL-2).	Thermofisher Científico	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Hisopos estándar estériles de alginato de calcio.	puritano	22029501
Raspador de células - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
tubo de centrífuga
Cristal violeta	Sigma Aldrich	C6158	Guarde el polvo en un lugar oscuro
Medio de águila modificado de Dulbecco - DMEM	GIBCO	41966029	Conservar a 4 °C hasta su uso
etanol	Sigma Aldrich	E7023
Suero fetal bovino -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Alícuota en tubos de 50 mL y mantener congelado hasta su uso
Células Vero	Colección de Cultura Tipo Americana ATCC	CRL-1586
Máquina de vórtice
metanol
Metilcelulosa
Tubo de microcentrífuga
Córneas porcinas	Park Packaging Co., Chicago, IL		Pedido especial bajo pedido
Cubiertas de banco de procedimiento, según sea necesario.	Thermofisher Científico	S42400
Pipetas serológicas	Thomas Científico	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Equipos de pipeteo serológico.	Thomas Científico	Ezpette Pro
estereoscopio	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Matraces de cultivo de tejidos, T175 cm2.	Thomas Científico	T1275
Incubadoras de cultivo de tejidos que pueden mantener un 5% de CO2 y una temperatura de 37 °C	Thermofisher Científico	Forma 50145523
Placas tratadas con cultivo de tejidos (6 pocillos).	Thomas Científico	T1006
tripsina