1. Deformaciones y manejo del HSV
NOTA: Para el ensayo se utilizan HSV-1(KOS) gL86 recombinantes no discontinuos y HSV-2 (KOS) 333gJ- con actividad reportera de beta-galactosidasa.
- Utilice virus de un solo lote y almacene a -80 °C en una proporción de 1:1 de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 20% de suero fetal bovino (FBS) y leche desnatada hasta su uso. Antes del almacenamiento del lote viral, determine la concentración del virus mediante el ensayo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal).
- Determine la viabilidad del virus y la multiplicidad de la infección (MOI) mediante tinción X-Gal para cada ensayo experimental ejecutado utilizando el ensayo de entrada de virus reportero, como se describió anteriormente (Figura 1).
- Virus diluido (Opt-MEM) al MOI deseado. Fijar las monocapas (paraformaldehído; 0,5 ml/pocillo) antes de teñir. Coloque los controles de viabilidad del virus en una placa de microtitulación separada en paralelo con las placas de ensayo polimicrobianas.
>2. Manejo de celdas HeLa 299
- Crece a 37 °C, 5% de CO2 en DMEM con 4,5 g/L de glucosa, 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, gentamicina (50 μg/ml) y L-glutamina. Células de paso al 80% de confluencia con la solución de tripsina (ácido etilendiaminotetraacético, 0,53 M EDTA; 0,05% de tripsina; 5 ml/matraz).
>3. Manejo de C. albicans
NOTA: C. albicans obtenida de una fuente de laboratorio clínico se almacena a -80 °C en el medio de leche desnatada Remmel 2x.
- Cultivo de caldo congelado en medio de dextrosa Sabouraud (37 °C). Después de 24 horas de subcultivo, C. albicans se coloca en medio fungisel (37 °C; 48 horas) para su uso.
- Generar formas de tubo germial (GT) (seleccionar colonias representativas; 3 ml FBS; 3 horas; 37 °C; absorbancia600 (Abs600), 0,3). Después de la incubación, lavar GT (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS; 2x; 4,000 x g). Añadir GT lavado al HBSS calentado (37 °C; 0,32 Abs600). Las formas GT deben ser el 99% de las células observadas según lo determinado por el recuento del hemocitómetro.
- Elabore suspensiones de caldo en forma de levadura (YF) seleccionando colonias representativas de hongos (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs600). Cuente el número de formas de FA/ml microscópicamente con un hemocitómetro. Las formas de FA deben ser el 99% de las células observadas según lo determinado por el recuento del hemocitómetro.
- Prepare caldo fúngico de trabajo (250 μl de caldo GT o YF en 25 ml de HBSS; 37 °C; 105 unidades formadoras de colonias, (UFC/ml)
>4. Manejo de S. aureus
- Tienda S. aureus Colección de Cultivos Tipo Americano, ATCC 25923 (-80 °C; Leche desnatada Remmel 2x). Cultivo en agar sangre de oveja (5%; 37 °C; 24 h). Recoger colonias representativas y transferirlas a un medio de sales de manitol en un plazo de 2 días para su almacenamiento (37 °C; 18 horas).
- Hacer suspensión de culata de S. aureus (3 ml HBSS; 1.32 Abs600 ;108 UFC/ml)
- Hacer caldo de trabajo de S. aureus (100 μl del caldo en 25 ml de HBSS; 105 UFC/ml).
>5. Suspensiones de Candida y S. aureus
- Hacer una suspensión mixta de C. albicans y S. aureus (250 μl de caldo YF o GT y 100 μl de caldo de S. aureus en HBSS de 25 ml).
6. Ensayo de biopelícula polimicrobiana
- Siembre placas de 96 pocillos con 200 μl de 2 x 105 células HeLa/ml (nivel de confluencia del 85%). Placas de roca (30 - 45 min; 37 °C) antes de la incubación (37 °C; incubadora con 5% de CO2; 18 h). Lavar monocapas (1x; Opt-MEM) y luego siembra con HSV (HSV-1 (KOS) gL86 o HSV-2 (KOS) 33 gJ- en 100 μl Opt-MEM ; MOI 50 y 10). Placas de incubación (3 horas; 37 °C; 5% CO2). Use solo una cepa viral por día.
- Lavar las monocapas infectadas (1x; solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Mg+2 y Ca+2; 100 μl). Reemplace el PBS por HBSS tibio dejando 25 μl en cada pocillo.
- Añadir suspensiones de trabajo YF, GT y/o S. aureus (100 μl; relación objetivo-célula =5:1; n=16) como se indica en la Tabla 1. Placas de incubación (estática; 30 min; 37 °C; 5% CO2).
- Después de la incubación, aspire una columna a la vez y rellene inmediatamente con 300 μl de PBS con Mg+2 y Ca+2. Repita este paso dos veces y luego agregue el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA; filtro esterilizado; 200 μl de una dilución 1:50).
- Triturar rápidamente el lisado de células HeLa y luego colocar 50 μl en sales de manitol (MS) y/o medios de fungisel (F) (Figura 2). Extienda el lisado con una varilla de vidrio doblada en un ángulo de 90°. Incubar las placas (18 h a 37 °C). Cuente manualmente el número de colonias por plato. Los controles consisten en la adherencia de S. aureus y/o C. albicans a células HeLa no infectadas por VHS.
Tabla 1. Determinación general de la adherencia microbiana en interacciones polimicrobianas.GT= Fenotipo del tubo germinativo de Candida albicans; YF= Fenotipo de la forma de levadura de C. albicans; MSSA= Staphylococcus aureus sensible a la meticilina; MS= medio de sales de manitol; F= Medio fungisel.
