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1. Soluciones y medios
- Prepare 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, solución salina tamponada con fosfato (PBS), caldo de dextrosa Sabouraud y agar dextrosa Sabouraud según la Tabla 1.
>2. Condiciones de crecimiento del inóculo fúngico
- Almacene todas las cepas fúngicas como caldos congelados en glicerol al 35% a -80 °C, hasta que las necesite.
- Realice los siguientes pasos antes de cada experimento.
- Para las cepas de Candida albicans:
- Descongele un vial madre y transfiera 200 μL a 10 mL de caldo de dextrosa Sabouraud en un tubo estéril de polipropileno de 50 mL con tapón y cultivo durante la noche a 30 °C con agitación (200 rpm). Recuerde inclinar el tubo y dejar la tapa ligeramente abierta para una mejor aireación del cultivo.
- Para las cepas de Cryptococcus neoformans:
- Raspe la superficie congelada de un vial de caldo. Colocar las células en placas de agar dextrosa Sabouraud e incubar durante 48 h a 30 °C. Después del crecimiento visible de colonias aisladas, mantenga las placas en el refrigerador (4 ° C) selladas con una película de parafina hasta por 15 días.
- Recoja una colonia aislada de tamaño mediano de la placa con un palillo de dientes estéril o un asa de inoculación estéril e inocule 10 mL de caldo de dextrosa Sabouraud en un tubo cónico estéril de 50 mL. Incubar durante aproximadamente 24 h a 30 °C bajo agitación (200 rpm).
- No exceder las 24 h de incubación. Recuerde inclinar el tubo y dejar la tapa ligeramente abierta para una mejor aireación. Siempre es bueno estandarizar la etapa de crecimiento de las células antes de cada prueba, ya que este es un factor importante que afecta la resistencia a los antimicrobianos.
nota: Ambos hongos se cultivaron a 30 °C para una rápida propagación en nuestros experimentos, pero la temperatura se puede cambiar para reflejar los objetivos del estudio, por ejemplo, el tratamiento clínico (37 °C). Lo más importante es que este tiempo de incubación inicial debe establecerse de antemano para cada aislado de hongo y mantenerse a lo largo de todas las pruebas para garantizar la reproducibilidad.
- Después del crecimiento de los hongos, recoja las células centrifugando los tubos cónicos a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mL de PBS.
- Vuelva a suspender las células y vuelva a centrifugar a 1.200 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Repita el lavado y la centrifugación de PBS dos veces más. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en 5 mL (según el tamaño del pellet) de medio 2X RPMI-1640.
- Prepare 1 mL de una dilución 1:100 o 1:1.000 en un tubo de microcentrífuga (dependiendo de la turbidez de la suspensión celular).
- Alícuota 10 μL de esta dilución, colóquela en una cámara de hemocitómetro y cuente el número total de células en los cuatro cuadrantes de las esquinas bajo el microscopio. Calcule la concentración mediante la fórmula: (número total de células/4) x factor de dilución x 104 (constante de dilución en cámara).
- Considere una viabilidad del 100% si los recuentos de viabilidad y las condiciones de crecimiento se han correlacionado sistemáticamente para el aislado que se está estudiando.
nota: La estandarización y el control de calidad de los recuentos de viabilidad se pueden realizar mediante el recubrimiento de acuerdo con el método de concentración inhibitoria mínima (MIC) antifúngica del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) para levaduras.
- Si no se ha establecido la correlación crecimiento/viabilidad para el aislado en estudio, se mida la viabilidad fúngica contando las células vivas en un hemocitómetro con la ayuda de colorantes que coloreen selectivamente las células muertas, como la floxina B11, el azul de tripán o el verde Janus. Utilice las células fúngicas para este protocolo solo si la viabilidad de la población en este punto es del 90% o más.
NOTA: Es posible que los tintes muertos/vivos no funcionen bien con el hongo de elección. Por favor, pruébelos antes de usarlos. Por ejemplo, el tinte azul de tripán no funciona bien con C. neoformans.
- Después de eso, prepare las suspensiones de celdas en medio RPMI-1640 2X (inóculo ajustado 2X en medio RPMI-1640). Para placas de 96 pocillos, considere un volumen de 5 mL para cada placa.
- Para todas las cepas de C. albicans, prepare una suspensión de células madre de 4 x 103 células/mL. Esta concentración es 2 veces la concentración final de celdas en cada pocillo (2 x 103 celdas/mL).
- Para las cepas de C. neoformans, prepare un cultivo madre de células de 2 x 104 células/mL. Esta concentración es el doble de la concentración final de células en cada pocillo (1 x 104 células/mL).
- Para otros hongos, pruebe con un antifúngico conocido cuya concentración será ideal para el estudio particular en relación con el tiempo de incubación. Tenga en cuenta el metabolismo y el tiempo de duplicación del hongo.
>3. Péptidos (Agente desconocido)
- Almacene los péptidos liofilizados a -20 °C y disuélvalos en agua desionizada antes de cada experimento. El tiempo máximo de almacenamiento una vez disuelto en agua dependerá de la naturaleza de cada péptido.
- Prepare alícuotas del doble de la concentración final más alta probada en el ensayo (2X). Lo ideal es preparar un pequeño número de alícuotas con suficiente péptido para un solo uso para evitar ciclos de congelación y descongelación.
nota: La elección de la concentración debe basarse en la literatura y en las propiedades del péptido. Se recomienda iniciar las diluciones seriadas con aproximadamente 100 μM del péptido, y luego disminuir o aumentar este rango de concentración en función de los resultados obtenidos.
>4. Referencia Antifúngicos (Controles Positivos)
- Para aquellos diluidos en agua: prepare una solución 2X de la concentración más alta del análisis (consulte la Sección 5: Ensayo antifúngico para los pasos de dilución).
- Para las cepas de C. albicans, prepare una solución de 128 μg/mL de fluconazol o 128 μg/mL de caspofungina. La concentración en placa para ambos será de 64 μg/mL.
- Para las cepas de C. neoformans, prepare una solución de 32 μg/mL de anfotericina B (solución soluble en agua). La concentración en placa será de 16 μg/mL.
NOTA: Normalmente, la anfotericina B se diluye en dimetilsulfóxido (DMSO), ya que este antifúngico es poco soluble en agua. Sin embargo, existen preparaciones de anfotericina B solubles en agua disponibles comercialmente.
- Para antifúngicos diluidos en un solvente orgánico: prepare una solución madre 100X en DMSO, luego dilúyala a 10X en agua para su uso.
nota: Así, en el pozo, la concentración final de DMSO no superará el 1%. Un pozo donde el hongo crecerá en medios que contengan 1% de DMSO como control es necesario dado que algunos hongos no toleran bien esta concentración del solvente. Recuerde que el DMSO es fotosensible, así que cubra la placa con papel de aluminio o colóquela en una cámara oscura durante el período de incubación.
>5. Ensayo antifúngico
NOTA: Los ensayos antifúngicos in vitro se realizan según la prueba de susceptibilidad a la microdilución de caldo de las directrices M27-A3 del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) con algunas modificaciones.
- Prepare una dilución en serie doble de cada péptido y controle el antifúngico en microplacas de poliestireno de 96 pocillos hasta un volumen final de 50 μL.
- Con una pipeta, añada 100 μL del antifúngico/péptido en la concentración 2X de la concentración final más alta deseada en las columnas 1-3, en la fila A.
- Con una pipeta multicanal, agregue 50 μL de agua estéril en los otros pocillos, en las filas B a H.
- Extraer 50 μL de los pocillos con la concentración más alta (fila A), transferir al siguiente pocillo de la siguiente concentración (fila B) y homogeneizar.
- Repita los pasos anteriores hasta el pocillo con la concentración más baja y deseche 50 μL de este pocillo (fila H). Deje las columnas 11 y 12 (filas A, B, C) con solo agua para el control en blanco o el control negativo/de crecimiento.
- Agregue 50 μL del inóculo ajustado 2X en medio RPMI-1640 a cada pocillo (columnas 1-3 más la columna 11 (negativo/control de crecimiento)); la concentración final para C. albicans será de 2 x 103 células/mL, y la concentración final para las cepas de C. neoformans será de 104 células/mL.
- Prepare controles en blanco (50 μL de agua + 50 μL de medio 2X RPMI-1640 sin celdas) y control negativo/de crecimiento (50 μL de agua + 50 μL de inóculo ajustado 2X RPMI-1640 medio sin antifúngico) y cárguelo en la placa del pocillo como se describe anteriormente.
- Repita el procedimiento para cada compuesto a analizar y el control antifúngico elegido (columnas 4-10).
nota: Las diluciones en serie se pueden hacer verticalmente como se muestra en el experimento a continuación, u horizontalmente en la placa (es decir, si el número de diluciones del compuesto/extracto dado que se necesita probar es de ocho o más).
- Si los compuestos, los fármacos de referencia o cualquiera de sus componentes son fotosensibles, realice el ensayo con luz reducida, cubra las placas con papel de aluminio o colóquelas en una cámara oscura durante las incubaciones.
- Tenga en cuenta las siguientes recomendaciones opcionales.
- Selle la placa con una placa de cubierta transparente que permita el intercambio de gases, ya que esto ayuda a reducir la evaporación.
- Coloque la placa en una cámara húmeda, ya que también ayudará a reducir la evaporación.
- Incubar las placas a 37 °C durante 24 h o 48 h para todas las cepas de C. albicans, y durante 48 h con agitación a 200 rpm para C. neoformans. El volumen final más bajo (100 μL) garantiza que no se produzcan desbordamientos.
nota: No se observaron diferencias significativas entre las lecturas de CMI a las 24 h y a las 48 h para las cepas de C. albicans. No obstante, las lecturas a las 48 h son más fáciles de visualizar.
- Observe todos los pocillos, con la ayuda de un microscopio óptico invertido, antes y después del período de incubación para verificar los cambios en la morfología, así como para verificar si hay signos de contaminación><.
nota: Las lecturas se pueden hacer visualmente y fotografiar al final del experimento. Antes de cada lectura, homogeneizar ligeramente la placa. Las lecturas también se pueden realizar midiendo su diámetro exterior a 600 nm, si no se observan agrupaciones de células o filamentación.
- Realice los experimentos al menos tres veces en fechas separadas.
Tabla 1. Preparación de medios y reactivos.
| Medio | preparación |
| 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (suplementado con L-glutamina y rojo de fenol; sin bicarbonato) |
| 330 mM de ácido propano sulfónico (MOPS) 3-(N-morfolino) |
| Ajuste a pH 7.0 con NaOH |
| Esterilizar por filtración (filtro de 0,22 μM) |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | 137 mM NaCl |
| 2.7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| Autoclave a 121°C durante 15 minutos. |
| Caldo de dextrosa Sabouraud | 15 g del polvo en 500 mL de agua destilada. |
| Ajuste a pH 7.0 con NaOH |
| Autoclave a 121°C durante 15 minutos. |
| Sabouraud Agar Dextrosa | 32,5 g del polvo en 500 mL de agua destilada. |
| Ajuste a pH 7.0 con NaOH |
| Autoclave a 121°C durante 15 minutos. |