Un ensayo de utilización de ATP para determinar la supervivencia bacteriana bajo tratamiento con antibióticos

Resumen

Fuente: Wang, Liang-Chun, et al. Examen cuantitativo de la susceptibilidad a los antibióticos de los agregados de Neisseria gonorrhoeae mediante ensayos comerciales de utilización de ATP y tinción de vivos/muertos. J. Vis. Exp. (2019).

Este video describe el sencillo ensayo de medición de ATP utilizando el reactivo de brillo de luciferasa. Este ensayo se utiliza para cuantificar la supervivencia de Neisseria gonorrhoeae después del tratamiento con ceftriaxona.

Protocolo

>1. Cuantificación de la viabilidad de las agregaciones de GC

1. Recoja el GC con un aplicador estéril. Frote el GC de la placa y vuelva a suspender el GC en un caldo precalentado (GCP, Tabla 1) suplementado con soluciones de NaHCO₃ al 4,2% y Kellogg al 1%. Utilice la espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm (un OD 650 de 1 = ~1 x 10⁹ UFC/mL) para determinar la concentración de bacterias en suspensión.
2. Ajuste la concentración de GC a ~1 x 10⁸ UFC/mL.
3. Agregue 99 μL de suspensión de GC ajustada en los pocillos de una placa de 96 pocillos.
4. Incubar la placa durante 6 h a 37 °C con 5% de CO₂ para permitir que las bacterias se agreguen.
5. Agregue 1 μL de ceftriaxona diluida en serie (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 μg/mL) en cada pocillo. Deje algunos pozos sin tratar para que sirvan como controles.
6. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C con 5% de CO₂.
7. Sonicar la suspensión 3 veces en cada pocillo durante 5 s a 144 W y 20 kHz.
8. Añada 100 μl de reactivo incandescente de utilización de ATP disponible en el mercado en cada pocillo, pipetee hacia arriba y hacia abajo 3 veces e incube durante 15 minutos a 37 °C con 5% de CO₂.
9. Transfiera con cuidado 150 μL de mezcla de cada pocillo a un nuevo pocillo en una microplaca negra de 96 pocillos y evite introducir burbujas.
10. Mida la absorbancia de cada pocillo a 560 nm utilizando el lector de placas.
11. Calcular la tasa de supervivencia por la relación entre la lectura obtenida después del tratamiento seriado con ceftriaxona y la lectura de pocillos no tratados.

>2. Análisis microscópico de fluorescencia de agregados vivos/muertos de GC

1. Recoja el GC con un aplicador estéril. Frote la GC de la placa y vuelva a suspender la GC en medios de GCP precalentados más suplementos de Kellogg al 1%.
2. Determine el número de bacterias por espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm y ajuste la concentración de GC a ~1 x 10⁷ UFC/mL.
3. Agregue 198 μL de suspensión de GC en cámaras de fondo deslizante de 8 pocillos.
4. Incubar la cámara durante 6 h a 37 °C con 5% de CO₂ para permitir la formación de agregación.
5. Añadir 2 μL de ceftriaxona (100 μg/mL o varias diluciones) en cada pocillo dentro de cada condición de agregación. Incubar durante el tiempo deseado a 37 °C con 5% de CO₂.
6. Añadir 0,6 μL de mezcla de solución de tinción viva/muerta en cada pocillo e incubar durante 20 min a 37 °C con 5% de CO₂.
7. Adquiera imágenes de la serie Z utilizando un microscopio confocal (se puede utilizar un microscopio equivalente).
8. Analice las imágenes utilizando el software ImageJ para medir el tamaño de los agregados de GC y la relación de intensidad de fluorescencia FIR de la tinción de vivos a muertos en cada agregado.

Tabla 1: Receta para 1 L de Medio de Crecimiento Bacteriano GCP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100x Suplemento de Kellogg's
agar-agar	Biológico de los Estados Unidos	A0930
Ensayo BacTiter	Promega	G8232
Ceftriaxona	TCI	C2226
Base media Difco GC	Bd	228950
Nitrato férrico, nonahidratado	Sigma-Aldrich	254223-10G
glucosa	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
Tinción de vivos/muertos BacLight	Invitrogen	L7012
MS11 Cepa de Neisseria gonorrhoeae			amablemente proporcionado por el Dr. Herman Schneider, Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed
Sonicador	Kontes		Equivalente a 9110001