Determinación de la función de las células similares a los neutrófilos en la sensibilidad de las células de linfoma a un fármaco de prueba

Resumen

Fuente: Hirz, T., et al. Aislamiento y análisis de neutrófilos para determinar su papel en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes terapéuticos. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra un ensayo que investiga el papel de las células similares a los neutrófilos en la protección de las células de linfoma contra la citotoxicidad de los agentes quimioterapéuticos. Se establece un cocultivo en 3D, que consiste en linfoma y células similares a los neutrófilos, y se expone a la vincristina, un medicamento de quimioterapia. El contacto directo con las células similares a los neutrófilos induce una regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas en las células de linfoma, promoviendo así su supervivencia en presencia de vincristina.

Protocolo

>1. Diferenciación de células HL60 a lo largo de la vía granulocítica y su cocultivo con células B de linfoma RL en modelo 3D

1. Diferenciación de células promielocíticas humanas (HL60) en células similares a los neutrófilos
   1. Ajuste el número de células HL60 a 3 x 10⁵ células/ml y, a continuación, añada 1 μM de ácido retinoico (AR) y 1,25% de DMSO para inducir su diferenciación. Siembre cada una de las 3 x 10⁵ células HL60 por pocillo en una placa de 48 pocillos, luego incube durante 48 horas a 37 °C con 5% de CO₂.
   2. Posteriormente, recoja las células y centrifugue a 300 g durante 5 min en RT. Vuelva a suspender las células con medio RPMI completo para el recuento utilizando el contador de viabilidad celular.
   3. A continuación, diluir la suspensión celular en medio RPMI completo para ajustar el número de células HL60 a 3 x 10⁵ células/ml e inducir de nuevo su diferenciación añadiendo 1 μM de ácido retinoico (RA) y 1,25 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Siembre cada 3 x 10^{5 células} HL60 por pocillo en una placa de 48 pocillos e incube durante otras 48 horas a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Análisis de la diferenciación de HL60 (HL60 diff)
   1. Recoja las células y centrifugue los tubos a 300 g durante 5 minutos en RT. Vuelva a suspender el pellet con medio completo del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) para el recuento utilizando el contador de viabilidad celular.
   2. Analizar los cambios en la expresión de marcadores de superficie celular por citometría de flujo. Coloque cada 3 x 10⁵ células HL60 indiferenciadas (procedentes de cultivo celular) y 3 x 10^{5 células} HL60 diff en tubos de plástico de 5 ml para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min en RT.
   3. Vuelva a suspender los gránulos en 50 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS)-Suero fetal bovino (FBS) (4%). Etiquete las células con CD11b antihumano conjugado a AF700 o CD38 antihumano conjugado con APC (5 μl/10⁶ células). Incubar las células en oscuridad durante 30 min a 4 ^oC.
   4. Lavar con 500 μl de PBS-FBS (4%) y luego centrifugar a 300 g durante 5 min en RT. Volver a suspender los pellets en 200 μl de PBS-FBS (4%).
   5. Analice en citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la Figura 1A y la siguiente configuración óptica: láser de 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP); láser de 633 nm: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Para probar los cambios morfológicos en HL60diff, inmovilice las células en portaobjetos de vidrio para su examen microscópico.
      1. Para ello, vuelva a suspender cada 3 x 10⁴ células HL60 indiferenciadas (procedentes de cultivo celular) y 3 x 10^{4 HL60} diff en un medio RPMI completo de 150 μl. Ensamble los portaobjetos de vidrio, las tarjetas de filtro y las cámaras de muestras en la centrífuga cytospin, asegurándose de que la centrífuga esté equilibrada.
      2. Coloque cada tipo de célula en la cámara de muestras y en la citocentrífuga a 1.500 rpm durante 10 minutos en RT. Retire los portaobjetos, las tarjetas de filtro y las cámaras de muestras de la centrífuga. Desmonte con cuidado, para no dañar las celdas de la corredera. Deseche las tarjetas de filtro y las cámaras de muestras.
      3. Tiña las células con el kit de tinción Giemsa y mantén los portaobjetos durante 1 hora para que se sequen. Examine las células con un microscopio con un aumento de 100X.
3. Cultura tridimensional (3D)
   nota: Asegúrese de que los materiales utilizados en este experimento estén fríos y que el experimento se lleve a cabo en hielo.
   1. Vuelva a suspender cada una de las células 5 x 10⁴ RL, solas o mezcladas con HL60diff en una proporción RL:HL60diff 1:10, con una matriz de membrana basal de 300 μl utilizando la punta de la pipeta de 1 ml cortada con una tijera estéril para ampliar la abertura a unos 2 o 3 mm. Evite las burbujas durante este paso.
   2. Siembre cada 300 μl de suspensión celular/pocillo en una placa de 24 pocillos. Evite las burbujas durante este paso. Incubar la placa durante 30 min a 37 °C con 5% de CO₂, luego agregar 1 ml de medio RPMI completo para cada pocillo e incubar durante 7 días a 37 °C con 5% de CO₂. Cambie el medio cada dos días. Añadir 10 nM de vincristina en el día 5.
4. Análisis FACS
   1. Después de 7 días de cultivo, aspirar el medio y lavar cada pocillo con 1 ml de PBS helado dos veces. Añadir 3 ml/pocillo de ácido PBS-etilendiaminotetraacético (EDTA) frío (5 mM). Separe el gel del fondo del pocillo raspando con el fondo de la punta de la pipeta de 200 μl. Agite el plato suavemente sobre hielo durante 30 min.
   2. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 ml y agite los tubos suavemente sobre hielo durante otros 30 minutos. Verifique la apariencia de una suspensión celular homogénea. (Si no es el caso, agite las celdas durante más tiempo o agregue más PBS-EDTA).
   3. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 min en RT. Laver los pellets con PBS y luego centrifugar a 300 x g durante 10 min en RT.
   4. Vuelva a suspender con PBS-FBS (4%) y marque con el anticuerpo anti-CD19 humano conjugado con PE-Cy7 y el anticuerpo anti-CD38 humano conjugado con APC (5 μl/10⁶ células). Incubar en oscuridad durante 30 min a 4 ^oC.
   5. Lavar con 500 μl de PBS-FBS (4%) y luego centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min en RT. Vuelva a suspender las células con anexina V y PI utilizando un kit comercial.
   6. Analice en citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la Figura 2A y la siguiente configuración óptica: láser de 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); Láser de 633 nm: APC (660/20 BP). Asegure la compensación de color.

Resultados

Figura 1. Parámetros estructurales de células HL60 diferenciadas. (A) Los gráficos de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) representan HL60 y células HL60 diferenciadas (HL60diff). (B) Las células HL60 y HL60diff se marcaron con anti-CD11b-AF700 o anti-CD38-APC seguidas de un análisis de citometría de flujo. Después de la activación d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
Solución salina tamponada con fosfato (PBS contiene calcio y magnesio)	Gibco Invitrogen	14040-091
Vincristine	EG labo
Matriz de membrana basal BD Matrigel	BD Biociencias	354234	Poner a 4 oC durante la noche antes del día del experimento
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Ácido retinoico	Sigma-Aldrich	R2625
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Kit de tinción V-FLOUS adjunto	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Kit de tinción Giemsa modificado	Cosmos Biomédico	CB361550-0000
Citometría de flujo LSRII	BD Biociencias
Citocentrífuga	Termo Científico
Microscopio Leica DMR-XA	Microsistemas Leica
Celómetro Auto T4 Contador de viabilidad celular	Nexcelom Biociencia