Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Inoculación de ratones C57BL/6 con células tumorales que expresan T Ag
- Cultive la línea celular de fibrosarcoma transformada en SV40 C57SV (o una línea celular similar adherente a T Ag+) en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de D-glucosa y L-glutamina (1x) y suplementado con 1 mM de piruvato de sodio y 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor en matraces tratados con cultivo de tejidos a 37 °C en atmósfera humidificada que contiene un 10% de dióxido de carbono (CO2).
- Una vez que las células se vuelvan completamente confluentes o ligeramente sobreconfluentes, retire y deseche suavemente el medio y enjuague la monocapa con solución salina estéril precalentada tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: La máxima expresión de T Ag se logra cuando las células T Ag+ alcanzan el 100% de confluencia.
- Dentro de una cabina de seguridad biológica, agregue ácido tripsina-etilendiaminatetraacético precalentado (tripsina-EDTA) (0,25%) para cubrir la monocapa a temperatura ambiente hasta que las células se desalojen en parches. Golpee los lados del matraz (s) de cultivo varias veces para liberar las células adherentes restantes.
NOTA: Si es necesario y para acelerar el proceso de tripsinización, transfiera el matraz o matraces a una incubadora a 37 °C. Las células desprendidas adoptarán rápidamente una forma redondeada bajo un microscopio óptico. Este paso debería durar aproximadamente 5 minutos.
- Añada 5 mL de medio DMEM y disocie los grumos para preparar una suspensión unicelular pipeteando el contenido de cada matraz hacia arriba y hacia abajo.
- Transfiera la suspensión celular a través de un filtro celular con poros de 70 μm a un tubo.
- Girar por el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células peletizadas en 10 mL de PBS estéril y frío.
- Repita los pasos 1.6 y 1.7 dos veces.
- Cuente las células con un hemocitómetro. Prepare una suspensión uniforme que contenga 4 x 107 células/mL de PBS estéril.
- Inyecte 500 μL de la suspensión anterior por vía intraperitoneal (i.p.) en cada ratón C57BL/6 adulto (6-12 semanas de edad), macho o hembra.
>2. Regímenes de tratamiento
- Régimen de tratamiento para examinar la contribución de las células nTreg a la inmunodominancia de TCD8
- Cuatro días antes del cebado in vivo de ratones C57BL/6 con células C57SV (paso 1.10), inyectar a cada animal una vez i.p. 0,5 mg de un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD25 con bajo contenido de endotoxinas y sin azida (clon PC-61.5.3), que agota las células nTreg, o con un control de isotipo IgG1 de rata (por ejemplo, clon KLH/G1-2-2, clon HRPN o clon TNP6A7).
- Régimen de tratamiento para probar la importancia in vivo de las interacciones de las proteínas de muerte celular programada (PD-1-PD-L1(2)) en la conformación de la inmunodominancia TCD8
NOTA: La interacción de PD-1 con PD-L1 a menudo, pero no siempre, media la coinhibición y/o el agotamiento de la TCD8 específica de Ag. Por lo tanto, el tratamiento con anti-PD-1 puede realizarse en paralelo con la administración de anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 y anti-PD-L2 para revelar la interacción intercelular exacta implicada en un fenómeno biológico.
>3. Preparación de los esplenocitos diana
- Sacrificar ratones C57BL/6 naïve emparejados por sexo (6-12 semanas de edad) que servirán como donantes de esplenocitos por luxación cervical.
- Coloque cada ratón con el abdomen hacia arriba dentro de un gabinete de seguridad biológica. Rocíe la piel con etanol al 70% (v/v), EtOH. Con pinzas y tijeras estériles, levante la piel y haga una pequeña incisión ventral en la línea media ventral. Luego, corte la piel en forma de cruz para exponer el peritoneo.
- Con fórceps, levante el peritoneo como una tienda de campaña sin arrebatar ninguno de los órganos internos. Cortar el peritoneo para exponer la cavidad peritoneal y extraer suavemente el bazo.
- Coloque el (los) bazo (s) dentro de un molinillo de papel Dounce de 15 mL que contenga 5 mL de PBS estéril. Aplique presión manual con el émbolo de vidrio del molinillo hasta que el tejido esplénico se disipe en una suspensión de células rojas homogéneas.
NOTA: Dependiendo del número de animales receptores por grupo experimental, pueden ser necesarios varios bazos de ratón donantes para la preparación de las células diana. Se pueden homogeneizar hasta 3 bazos juntos dentro de un molinillo de 15 mL.
- Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mL. Girar por el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante. Resuspender las células peletizadas en 4 mL de tampón de lisado de cloruro de amonio-potasio (ACK) durante 4 min para eliminar los eritrocitos.
NOTA: Este es un paso urgente. La sobreexposición de los esplenocitos al tampón de lisado ACK aumentará su fragilidad y los hará susceptibles a la muerte celular inespecífica.
- A cada tubo, agregue 8 mL de medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) que contenga 10% de FBS inactivado por calor, L-alanil-L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales de medios esenciales mínimos (MEM), 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico (HEPES) y 1x penicilina/estreptomicina, que en lo sucesivo se denominará medio RPMI completo (Tabla de materiales).
- Transfiera el contenido a través de los poros de 70 μm de un filtro de células a un nuevo tubo de 15 ml.
- Girar por el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células peletizadas en 12 mL de RPMI completo.
- Divida la suspensión de esplenocitos en 3 porciones iguales (4 ml cada una) en 3 tubos separados.
>4. Recubrimiento de esplenocitos objetivo con péptidos irrelevantes y afines
- Etiquete los tubos de acuerdo con los péptidos que se utilizarán para pulsar los esplenocitos objetivo. Los esplenocitos de control serán pulsados con un péptido irrelevante, y cada población de esplenocitos diana afines será pulsada con un péptido sintético correspondiente al epítopo inmunodominante derivado de T Ag (sitio IV) o a un epítopo subdominante de T Ag (sitio I o sitio II/III) (Tabla 1).
NOTA: La elección de péptidos irrelevantes depende de la configuración experimental y de la cepa de ratón utilizada en cada investigación. Los autores a menudo utilizan gB498-505 (un epítopo peptídico inmunodominante restringido aH-2K b del virus del herpes simple [VHS]-1) y/o GP33-41 (un epítopo peptídico inmunodominante restringido a H-2Db del virus de la coriomeningitis linfocítica ([LCMV]) en ratones C57BL/6 (Tabla 1). Estos péptidos son opciones óptimas porque: (i) se derivan de patógenos que no se han encontrado previamente en el modelo de ratón descrito aquí; (ii) similares a los péptidos derivados de T Ag, gB498-505 y GP33-41 están restringidos y se unen a moléculas H-2b. En los ensayos de matanza in vivo de "tres picos", cada uno de los dos picos que corresponden a células diana afines puede representar esplenocitos pulsados con un péptido inmunodominante o subdominante. La elección de cada conjunto de péptidos varía según los objetivos de cada experimento. Véanse las Figuras 1 y 2 como ejemplos de dicha variación. Para el resto de este protocolo, los sitios I y IV derivados de T Ag representarán péptidos subdominantes e inmunodominantes, respectivamente.
- Pulse el contenido de cada tubo marcado con 1 μM del péptido respectivo durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.
- Use un filtro de células separado (con poros de 70 μm) para cada tubo para eliminar los grumos y los desechos si es necesario.
- Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células peletizadas en 12 mL de PBS frío estéril y repita el paso 4.4 una vez más.
NOTA: Es importante eliminar la mayor cantidad posible de FBS porque FBS puede unirse al éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) en el siguiente paso.
>5. Marcaje de esplenocitos diana con CFSE
- Resuspender los esplenocitos pulsados por péptidos en 4 mL de PBS estéril.
- Agregue CFSE a 0,025 μM, 0,25 μM y 2 μM en los tubos que contienen esplenocitos pulsados de péptido irrelevante, sitio I y sitio IV, respectivamente.
NOTA: Para lograr un etiquetado uniforme de CFSE, sostenga cada tubo en un ángulo de 45° antes de agregar CFSE al lado ligeramente por encima de la suspensión de la celda, seguido inmediatamente de un suave vórtice. Esto asegurará la apariencia de histogramas suaves al final. No son infrecuentes las variaciones de las intensidades de CFSE de un lote a otro y dependientes de la edad. Por lo tanto, es posible que sea necesario experimentar con dosis diferenciales de CFSE antes de decidir las concentraciones óptimas que se utilizarán.
cautela: El CFSE es tóxico en concentraciones superiores a 5 μM.
- Coloque los tubos dentro de una incubadora a 37 °C durante 15 minutos e inviértalos una vez cada 5 minutos.
- Agregue 3 mL de FBS inactivado por calor a cada tubo para detener la reacción CFSE. Rellene el contenido con PBS estéril.
- Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células peletizadas en 12 ml de PBS estéril y repita el paso 5.5.
>6. Examen del etiquetado adecuado/igual de CFSE de las poblaciones de esplenocitos objetivo
- Resuspenda las células peletizadas en 3 mL de PBS.
- Agita los tubos suavemente. Transfiera 10 μL, cada uno, de suspensiones de célulasCFSE bajo, CFSEintermedio (int) yCFSE alto a un tubo de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) de poliestireno de fondo redondo de 5 mL que contiene 200 μL DE PBS.
- Interrogue a las células con un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm. Dibuje una puerta de linfocitos basada en las propiedades de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) de las células antes de adquirir 5000 eventos que caen dentro de la puerta de linfocitos en el canal FL-1.
- Dentro de la población CFSE+ "principal", dibuje puertas de histograma adicionales para identificar las subpoblacionesde CFSE bajo,CFSE int yCFSE alto.
- Confirme números de eventos iguales o casi iguales dentro de las tres puertas. Si es necesario, ajustar el número de células en los tubos "fuente" (paso 6.1) antes de mezclar e inyectar esplenocitos diana en ratones naïve y preparados en la sección 7.
>7. Inyección de células diana marcadas con CFSE en receptores naïve y con T-Ag
- Vórtice suavemente los tubos fuente. Transfiera las tres suspensiones celulares marcadas con CFSE en proporciones iguales a un tubo nuevo.
- Rellene el contenido con PBS estéril.
- Centrifugar por el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células peletizadas con PBS estéril.
- Cuente las células en azul de tripán con un hemocitómetro para garantizar una viabilidad celular de al menos el 95%.
- Ajuste el volumen para inyectar 1 x 107 células diana mixtas/200 μL PBS por vía intravenosa (i.v.), a través de la vena de la cola, en cada ratón receptor C57BL/6.
NOTA: Guarde las células en hielo entre inyecciones. Mezcle suavemente las células objetivo antes de cada inyección. Registre el momento exacto de la inyección para cada ratón, lo que determinará cuándo será necesario sacrificar al animal. Es importante mantener la duración de la citotoxicidad in vivo constante entre todos los animales del mismo experimento.
8. Adquisición de datos
- Dos o cuatro horas después de la inyección de las células diana marcadas con CFSE, se sacrifica a los ratones receptores por luxación cervical.
NOTA: La duración de la citotoxicidad in vivo puede variar en función del sistema experimental empleado, la inmunogenicidad de los Ags diana, la abundancia prevista de TCD8 específico del antígeno peptídico en el bazo y la robustez de su función lítica, entre otros factores.
- Retire y procese cada bazo por separado como en los pasos 3.2-3.9.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en 3 mL de PBS.
NOTA: Antes de los análisis citofluorimétricos, tenga especial cuidado de manipular el tejido esplénico y las preparaciones celulares a 4 °C o en hielo. Esto es para evitar la continuación de la citotoxicidad ex vivo.
- Transfiera aproximadamente 1x107 células de cada bazo procesado a un tubo FACS limpio.
- Interrogue las células inmediatamente con un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm. Dibuje una puerta de linfocitos basada en las propiedades FSC y SSC de las células.
- Identificar los esplenocitos del receptor de CFSE y las células diana transferidas a CFSE+. Extraiga puertas adicionales que se adapten a distintas poblaciones de células objetivo con CFSEbajo,CFSE int yalto CFSE.
- Adquirir un total de 2000 eventos CFSEbajos en el canal FL-1.
>9. Análisis de datos
- Calcule la lisis específica de cada población de células diana afines utilizando la siguiente fórmula:
% Citotoxicidad específica = 
donde x = número de eventoCFSE int/alto en ratón T Ag, y = númerode evento bajo CFSE en ratón T Ag preparado, a = número de eventoCFSE int/alto en ratón ingenuo y b = númerode evento CFSE bajo en ratón ingenuo.
nota: En los ensayos de citotoxicidad de «tres picos» en los que se evalúa la lisis específica de más de una población diana afín, no es adecuado utilizar frecuencias de células diana. Esto se debe simplemente a que la frecuencia de una población de células diana afines está influenciada no sólo por el porcentaje de los controles irrelevantes, sino también por el de los otros esplenocitos diana afines. Por lo tanto, los números de eventos dentro de cada puerta deben usarse en la fórmula anterior para calcular con precisión la lisis de cada población de células diana afines (ya sea CFSEint o CFSEhigh cells) frente a controlesCFSE bajos.
Tabla 1. Péptidos introducidos en este protocolo.
| Fuente de antígeno proteico | Epítopo peptídico | designación | secuencia | Restricción de MHC I |
| SV401 T Ag2 grande | T Ag206-215 | Sitio I | SAINNYAQKL | H-2Db |
| SV40 T Ag Grande | T Ag223-231 | Sitio II/III | CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 T Ag Grande | T Ag404-411 | Sitio IV | VVYDFLKC | H-2Kb |
| SV40 T Ag Grande | T Ag489-497 | Sitio V | QGINNLDNL | H-2Db |
| HSV-13 Glicoproteína B | gB498-505* | gB498-505 | SSIEFARL | H-2Kb |
| LCMV4 Glicoproteína | GP33-41* | GP33-41 | KAVYNFATC | H-2Db |
| 1Virus Simio 40 | | | | |
| 2Antígeno tumoral grande | | | | |
| 3Virus del Herpes Simple tipo 1 | | | |
| 4Virus de la coriomeningitis linfocítica | | | |
| *utilizado como péptido irrelevante | | | |
