Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>Nota: El plásmido utilizado Lifeact-mCherry es un amable regalo del Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, París.

1. Células y transfección

>Nota: Los macrófagos RAW264.7 se cultivan hasta la subconfluencia en medio completo (medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, 10 mM HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 50 μM β-mercaptoetanol, 2 mM L-Glutamina y 10% FCS (Suero Fetal de Ternero)) en una placa de 100 mm. Se transfectan con plásmidos que codifican proteínas marcadas con fluorescencia por electroporación. Rutinariamente, aproximadamente 5 - 6 x 10⁶ células se transfectan con 20 μg o 10 μg de plásmido para cada transfección o co-transfección, respectivamente. Tenga en cuenta que se pueden utilizar otros medios de transfección basados en la electroporación o la lipofección como enfoques alternativos.

1. Raspe las células con un elevador de células y vuelva a suspenderlas en 10 ml de medio de cultivo pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
2. Centrifugar la suspensión de la célula 300 x g, 5 min a RT en rotor de ángulo oscilante.
3. Precalentar 10 ml de medio completo suplementado con 10 μg/ml de gentamicina a 37 °C.
4. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de "tampón de lavado A" del kit de electroporación.
5. Centrifugar la suspensión de la célula 300 x g, 5 min a temperatura ambiente en rotor de ángulo oscilante.
6. Mientras tanto, prepare la mezcla de ADN a temperatura ambiente: 120 μl 2x Tampón B, 20 μg de ADN plásmido que codifica para la proteína de interés, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. Después de la centrifugación, deseche todo el sobrenadante.
8. Vuelva a suspender el pellet de celda en la mezcla de ADN y transfiéralo a cubetas de electroporación de 4 mm.
9. Incubar en RT durante 3 min.
10. Electroporado a 250 V, 900 μF.
11. Vuelva a suspender inmediatamente las células en el medio completo precalentado (37 °C) suplementado con gentamicina y colóquelas en un plato de 100 mm.
12. Incubar las células transfectadas durante la noche a 37 °C, 5% de CO₂.
13. A la mañana siguiente, sustituya el medio completo por 10 ml de medio de microscopía sin suero (RPMI 1640 sin rojo de fenol, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sodio, 50 μM de β-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina).

>2. Opsonización de glóbulos rojos

>Nota: Como modelo de partícula objetivo para macrófagos, se utilizan glóbulos rojos de oveja (SRBCs). Por lo general, se utilizan alrededor de 7 x 10⁶ SRBC por plato con fondo de vidrio de 35 mm.

1. Lavar los SRBC con 100 μl de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato)/0,1% BSA (albúmina sérica bovina) y centrífuga (600 x g, 4 min).
2. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los SRBC en 100 μl de 1x PBS/0,1% BSA y centrífuga (600 x g, 4 min).
3. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los SRBC en 1x PBS/0,1% BSA con IgG de conejo anti-SRBC a concentración subaglutinante. Utilice 500 μl de solución que contenga anticuerpos/5 μl de SRBCs.
   nota: La concentración subaglutinante de anticuerpos corresponde a la concentración más baja que no indujo aglutinación detectada como formación de una red. En general, la concentración subaglutinante es de 8,2 μg/ml.
   1. Determinar la concentración de IgG anti-SRBCs necesaria para opsonizar los SRBCs mediante una prueba de hemaglutinación. Diluir en serie las IgG anti-SRBC (stock a 13,1 mg/ml) entre 1/50 - 1/25.600 en una microplaca. Agregue 2 x 10⁶ SRBC en cada pocillo. Incubar la placa en la oscuridad a RT durante varias horas.
4. Incubar en RT durante 30 minutos con rotación lenta.
5. Después de dos lavados en 1x PBS/0,1% BSA como se ha descrito anteriormente, vuelva a suspender los SRBC opsonizados con IgG (IgG-SRBC) en un medio de microscopía sin suero precalentado (2 ml/plato).

>3. Recubrimiento de polilisina de cubreobjetos

1. Mientras tanto, trate platos con fondo de vidrio de 35 mm con 2 ml de poli-L-lisina al 0,01% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2. Lavar los platos dos veces con 2 ml de 1x PBS.

>4. Fijación no covalente de SRBCs en placas con fondo de vidrio

1. Vierta 2 ml de suspensión SRBCs por plato con fondo de vidrio de 35 mm.
2. Centrífuga con rotor oscilante a 500 x g durante 2 min en platos con fondo de vidrio de 35 mm.
3. Retirar el sobrenadante y lavar una vez con 2 ml de 1x PBS/10% BSA.
4. Incubar las partículas durante 30 min con 2 ml de 1x PBS/10% BSA por plato.
5. Lavar los platos tres veces con 2 ml de 1x PBS.
6. Sustituya 1x PBS por 2 ml de medio de microscopía sin suero precalentado (37 °C).

>5. Fagocitosis visualizada por TIRFM

1. Microscopio
   nota: El TIRFM se realizó utilizando un microscopio equipado con un objetivo de inmersión en aceite (N 100X, NA1.49), una cámara de calentamiento con CO₂ y dos cámaras de detección de fotón único EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) acopladas a una lente de 1.5X.
   1. El día antes de la sesión de microscopio TIRF, encienda la cámara de calentamiento a 37 ºC para permitir un calentamiento homogéneo de la platina del microscopio.
2. Determinación del ángulo crítico
   nota: El software ImageJ Color Profiler se utiliza para procesar flujos de imágenes TIRF.
   1. Coloque debajo del microscopio una placa con fondo de vidrio de 35 mm que contenga SRBC opsonizado con medio de microscopía sin suero.
   2. Raspe las células y vuelva a suspenderlas en el medio antes de agregarlas (100 - 500 μl) en el plato.
   3. Utilice el software "Live Acquisition" para controlar el microscopio y realizar la excitación con un láser de 491 nm y/o 561 nm para identificar células que expresan proteínas marcadas con fluorescencia.
   4. Identificar una célula que expresa las proteínas marcadas con fluorescencia.
   5. Colóquelo en el centro del campo y adquiera 500 imágenes a una longitud de onda de excitación, con diferentes ángulos desde 0º hasta 5º, con un incremento de 0,01º (Figura 1A). Los ángulos son modificados automáticamente por el sistema de microscopio.
   6. Determine el ángulo crítico que permite que la luz incidente se refleje totalmente en la interfaz vidrio/medio y genere la onda evanescente. Con el software ImageJ Color Profiler, abra la secuencia de imágenes haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y seleccione el archivo.
   7. Seleccione una región de interés (ROI), con la herramienta rectangular, en la celda con una fluorescencia uniforme (Figura 1B amarillo 1).
   8. Trace la intensidad de fluorescencia media del "perfil del eje Z" medida en el ROI con función de los ángulos en el eje x haciendo clic en la pestaña "Imagen", "Pilas" en el menú desplegable y "Trazar perfil del eje Z" (Figura 1B rojo 2).
      Nota: El ángulo crítico es el ángulo que conduce a la fluorescencia máxima antes de una disminución brusca de la fluorescencia.
   9. Utilice cualquier valor de ángulo en el eje x superior al ángulo crítico durante la sesión de microscopía para obtener una señal TIRF como ejemplo 2.00 (Figura 1C).
3. Adquisiciones
   1. Utilizando el software Live Acquisition, configure los parámetros de adquisición con el módulo "Editor de protocolos" (Figura 2A).
      1. Cree un protocolo con un "bucle" que comprenda la adquisición de "Multi Canales" para adquirir señal fluorescente de proteínas de interés en la región TIRF. Introduzca el ángulo TIRF (por ejemplo, 2,00), el tiempo de exposición (por ejemplo, 50 mseg) y la intensidad del láser (por ejemplo, 50%) (Figura 2B 1).
      2. Introduzca un "movimiento Z" del objetivo a 3 μm por encima de la región TIRF para obtener la adquisición de señales en epifluorescencia con la herramienta "Multi Channels". Introduzca un ángulo por debajo del ángulo crítico (como ejemplo 1,00), el tiempo de exposición (50 mseg) y la intensidad del láser (50%) (Figura 2B, 2 y 3).
      3. A continuación, agregue un "movimiento z" del objetivo 3 μm por debajo, para regresar en la región TIRF (Figura 3B 4). Agregue una "instantánea" de la celda en un LED de luz brillante (diodo emisor de luz) (Figura 2B 5).
   2. Encuentre una célula de interés con un nivel moderado de expresión de proteínas marcadas con fluorescencia que inicie la fagocitosis de SRBC al extender la membrana plasmática alrededor de la partícula.
   3. Colócalo en el centro del campo.
   4. Inicie la adquisición de streaming de 500 a 1.000 fotogramas. En la pestaña "recuento de bucles", introduzca "750 fotogramas" (Figura 2B 1).
      nota: El software ImageJ Color Profiler se utiliza para procesar flujos de imágenes TIRF.
   5. Abra las imágenes de secuencia en el software Image J haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y eligiendo el archivo.
   6. Separe los canales haciendo clic en la pestaña "Imagen", en el menú desplegable "Hyperstacks" y en la función "Stack to hyperstack". Complete la ventana que aparece: Orden: xyctz; Canal (c): número de canales (por ejemplo: "2" si tiene dos fluorocromos); Cortes (z): número de cortes en el eje z (por ejemplo: "1" si no hay movimiento en el eje z); Fotogramas (t): número de imágenes divididas por número de canales; Modo de visualización: Grayscale.
      nota: Se generan dos secuencias de imágenes separadas, correspondientes a los dos canales diferentes.

Figura 1. Representación esquemática del "Phagosome Closure Assay" analizado por TIRFM. El ensayo de cierre de fagosomas se realiza utilizando macrófagos que expresan transitoriamente una o dos proteínas marcadas con fluorescencia. Los macrófagos se depositan en SRBC opsonizados con IgG fijados de forma no covalente en cubreobjetos recubiertos de polilisina. Las imágenes se registran en modo TIRF para detectar el sitio de cierre del fagosoma y en modo de epifluorescencia para detectar la base de la copa fagocítica.

Figura 2: Determinación del ángulo crítico para TIRFM. (A) Usando "Adquisición en vivo", una célula que expresa proteínas marcadas con fluorescencia se coloca en el centro del campo (región 1 en rojo). Con la opción TIRF Stack, las imágenes se adquirieron en una longitud de onda de excitación, con diferentes ángulos desde 0° hasta 5°, con un incremento de 0,01° (región 2 en rojo). (B) La secuencia de imágenes se abre utilizando el software ImageJ Color Profiler y la intensidad de fluorescencia media de una región de interés (ROI) se traza con la función de los ángulos en el eje x usando "Pilas" y "Perfil del eje PlotZ" (región 1 en rojo). (C) La posición x del pico de fluorescencia en el gráfico corresponde al ángulo crítico: 1,98° (línea punteada negra). Se puede utilizar cualquier valor después de este ángulo. Por ejemplo, se puede elegir 2,00° (línea roja).

Figura 3. Proceso de flujo de trabajo utilizando el módulo de adquisición en vivo: "Editor de protocolo". (A) En la ventana "Editor de protocolos", se crea un lienzo de flujo de trabajo. (B) Este protocolo comprende un "bucle" de acciones que el microscopio repetirá el número de veces decidido por el usuario. A modo de ejemplo: 750 (1). Un bucle incluido: adquisición "Multi Canales" con excitación láser de proteínas fluorescentes de interés en modo TIRF. Como ejemplo: Láser 491 nm intensidad 50% -ángulo TIRF 2.00 (2); "Movimiento Z" del objetivo 3 μm (3); Adquisición "Multi Canales" en modo de epifluorescencia (4); "Movimiento Z" del objetivo de vuelta a la región TIRF (5) y una "Instantánea" en luz transmitida (6).