>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Aislamiento en gradiente de densidad de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)
- Añadir 25 ml de sangre entera heparinizada en un tubo de 50 ml con una pipeta de 25 ml.
- Diluir las células con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Añadir 15 ml de gradiente de densidad Ficoll-Paque en un nuevo tubo de 50 ml y, mientras se inclina el tubo, añadir muy lentamente y con cuidado 25 ml de la suspensión celular diluida sobre el gradiente de densidad para que no se mezcle toda la sangre con el gradiente de densidad, es decir, no se altere la interfaz del gradiente de densidad sanguínea.
- Centrifugar la suspensión desde el paso 1.2 a 400 × g durante 30 a 40 min en un rotor de cuchara oscilante sin freno a temperatura controlada a 20 °C.
nota: Después de la centrifugación, deben aparecer tres capas distintas: la capa superior es el plasma; la capa clara inferior es el gradiente de densidad de Ficoll-Paque; y una delgada capa celular intermedia que son las PBMC.
- Aspire y deseche la capa superior por succión con una pipeta Pasteur, con cuidado de no alterar la capa de interfase de las células mononucleares (es decir, linfocitos, monocitos y plaquetas).
- Recoja cuidadosamente esta capa de células mononucleares con una pipeta de 10 ml en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml.
- Llene el tubo con 20 ml de PBS, mezcle bien y centrifugue a 300 × g durante 10 min a 20 °C. Retire completamente el sobrenadante después de la centrifugación.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 20 ml de PBS y centrifugue a 200 × g durante 10-15 min a 20 °C. Retire completamente el sobrenadante después de la centrifugación.
nota: Este paso elimina las plaquetas, que no son deseadas, dentro de las PBMC; Este paso se puede repetir para asegurar la eliminación completa de las plaquetas.
- Si no se desea seleccionar poblaciones específicas, vuelva a suspender el pellet celular en medio completo de leucocitos (10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina en medio RPMI-1640) para el cultivo después de realizar un recuento celular para suspender 1 ml de medio por 107 PBMC antes de continuar con el siguiente paso.
>2. Marcaje magnético de poblaciones de leucocitos
- Centrifugar la suspensión de PBMC a 300 × g durante 10 min y aspirar el sobrenadante por completo.
- Vuelva a suspender el pellet celular en 80 μl de PBS por cada 107 células totales.
- Agregue 20 μl de perlas magnéticas especificadas (es decir, perlas magnéticas CD14 para el aislamiento de monocitos, perlas magnéticas CD4 para el aislamiento de linfocitos T) por cada 107 células totales.
- Mezclar bien e incubar durante 15 min a 2 a 8 °C en el frigorífico.
- Añadir 1-2 ml de PBS por cada 107 células para lavar y centrifugar a 300 × g durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante completamente y resuspender hasta 108 células en 500 μl de PBS.
>3. Selección magnética de subpoblaciones de leucocitos
Nota: Una variedad de separadores y columnas de perlas magnéticas están disponibles para el aislamiento de una población específica de leucocitos por marcador de superficie celular de varios fabricantes. El aislamiento puede ser por selección positiva basada en uno o unos pocos marcadores positivos o por selección negativa después del agotamiento de poblaciones no deseadas. A continuación, se describe un enfoque general para realizar la selección positiva utilizando un marcador (es decir, CD4 para los linfocitos T colaboradores o CD14 para los monocitos).
- Prepare y cebe el separador magnético, incluida la columna de separación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Aplique el tubo que contiene la muestra de PBMC marcadas. Proporcione dos tubos de centrífuga de 15 ml para la recolección de las fracciones celulares marcadas positivamente y no marcadas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Cuente el número de células y vuelva a suspender los leucocitos seleccionados positivamente (es decir, linfocitos T CD4+ o células CD14+) en medio completo de leucocitos, utilizando 1 ml de medio por cada 107 células.
>4. Tinción de éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) de leucocitos para la evaluación de la proliferación
>Nota: El CFSE se ha utilizado ampliamente en investigaciones inmunológicas, tanto para estudios in vivo como in vitro. Nuestro protocolo ha sido optimizado para el estudio in vitro de las interacciones MSC/PBMC (u otros leucocitos). Si bien los pasos generales involucrados en la realización del etiquetado in vitro de CFSE son similares, puede haber diferencias en la dosis específica y el momento del protocolo. Esto puede deberse a una serie de factores, es decir, el tipo de célula específico utilizado, el número de células utilizado, que probablemente pueden afectar la intensidad de la señal fluorescente CFSE.
- Diluir la solución madre de CFSE (10 mM) en PBS hasta la concentración de trabajo deseada de 10 μM (solución de trabajo de CFSE). Prepare de 10a 7 celdas (es decir, PBMC o células T) para el etiquetado con la solución de trabajo CFSE.
- Centrifugar a 300 × g durante 10 min para obtener un pellet celular y aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células suavemente en 1 ml de solución de trabajo CFSE precalentada (37 °C) e incube las células durante 10 minutos a 37 °C.
- Para lavar el exceso de CFSE, diluya la suspensión celular con 10x (por volumen) de medio RPMI preenfriado (4 °C) que contenga 10% de FBS. Sedimentar las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Lave el pellet de celda de esta manera dos veces más.
- Vuelva a pellet las células por centrifugación y cuente el número de células. Vuelva a suspender 107 células (PBMC o células T) en 1 ml de medio completo de leucocitos fresco precalentado.
>5. Ensayo de supresión de efectores Leucocitos inmunomoduladores inducidos por MSC seleccionados con perlas magnéticas en células T efectoras CD4 + marcadas con CFSE activadas
- Siembre MSC a 250.000 células en 3 ml de medio completo de MSC en placas de 6 pocillos (densidad de MSC: 25.000 células/cm2) para su fijación O/N en una incubadora a 37 °C, permitiendo que las células madre alcancen el 80% de confluencia. Se necesitan al menos 3 placas de 6 pocillos para garantizar que haya suficientes PBMC cocultivadas con MSC para la selección de subpoblaciones.
- Aspire el medio y agregue PBMC separadas según el Paso 1 pero en placas de 6 pocillos a 2,5 x 106 células/pocillo (densidad celular: 250.000 leucocitos/cm2) con 3 ml de medio completo de leucocitos. Co-cultivo durante 48-72 h en una incubadora a 37 °C.
- Selección de perlas magnéticas de leucocitos inmunomoduladores inducidos por MSC (es decir, células CD14+) según las Secciones 2-3.
nota: En este punto se puede realizar la tinción de citocinas intracelulares para el análisis de citometría de flujo para evaluar los cambios en el perfil de expresión de citocinas leucocitarias, es decir, la expresión de interleucina-10 modulada por MSC.
- Agregue linfocitos T CD4+ alogénicos marcados con CFSE generados según las Secciones 2-4 en placas de 24 pocillos en 1 ml de medio completo de leucocitos (densidad de linfocitos T: 250.000 células/cm2) a leucocitos inducidos por MSC seleccionados con perlas en varias proporciones, es decir, proporciones 1:10, 1:5, 1:2 y 1:1 (célula a célula).
- Para estimular las células T CD4+, agregue microesferas conjugadas α-CD3/28 para obtener una proporción de perlas a células de 1:1.
- Para un control negativo, coloque 500.000 linfocitos T CD4+/pocillo en una placa de 24 pocillos (densidad de linfocitos T: 250.000 células/cm2) con 1 ml de medio completo leucocitario solamente; para un control positivo, además de sembrar el mismo número de linfocitos T CD4+/pocillo, añada microperlas conjugadas α-CD3/28 para obtener una proporción de perlas a células de 1:1.
- En el tercer día de cocultivo, evalúe la proliferación de células T CD4+ marcadas con CFSE (colocadas en tubos de fondo redondo) mediante análisis de citometría de flujo con excitación de 488 nm y filtros de emisión apropiados para la fluoresceína.