Ensayo in vitro para evaluar el impacto inmunomodulador de los monocitos en la proliferación de leucocitos

Resumen

Fuente: Hsu, P., et al. Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSCs). J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra un ensayo in vitro para explorar la influencia inmunomoduladora de las células madre mesenquimales (MSC) en la proliferación de células T efectoras. El ensayo incluye el cocultivo de MSC con PBMC para inducir a la población de monocitos a adquirir un fenotipo inmunomodulador, lo que conduce a la secreción de interleucina-10 (IL-10). Después de la incubación con linfocitos T CD4⁺ activados, los monocitos inducidos suprimen eficazmente la proliferación de linfocitos T.

Protocolo

>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>1. Aislamiento en gradiente de densidad de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)

1. Añadir 25 ml de sangre entera heparinizada en un tubo de 50 ml con una pipeta de 25 ml.
   1. Diluir las células con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Añadir 15 ml de gradiente de densidad Ficoll-Paque en un nuevo tubo de 50 ml y, mientras se inclina el tubo, añadir muy lentamente y con cuidado 25 ml de la susp....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ficoll-Paque PLUS	GE Cuidado de la Salud	71-7167-00 AG	Densidad grandiosa para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
Vibrante kit de trazador celular CFDA-SE (CFSE)	Tecnologías de la Vida	V12883	Marcaje celular para la detección de la división celular
Dynabeads Activador T Humano CD3/28	Tecnologías de la Vida	111.32D	Activación de linfocitos T humanos, por ejemplo, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, etc.
Separador autoMACS™	Miltenyi Biotec	Separador autoMACS™	Separador de células de base magnética
Columnas autoMACS®	Miltenyi Biotec	130-021-101	Columnas de separación
Microperlas CD14 humanas	Miltenyi Biotec	130-050-201	Para la selección positiva de monocitos y macrófagos humanos CD14+ de PBMC
Microperlas CD4 humanas	Miltenyi Biotec	130-045-101	Para la selección positiva de linfocitos T humanos CD4+ de PBMC
RPMI 1640 Medio	Tecnologías de la Vida	Año 11875	PBMC humano/medio de cultivo de leucocitos
DMEM, Glucosa baja, piruvato	Tecnologías de la Vida	Año 11885	Medio de cultivo de células madre mesenquimales humanas (MSC)
L-glutamina	Tecnologías de la Vida	25030-081	Suplementación para MSC medio completo
Penicilina/Estreptomicina	Tecnologías de la Vida	15070-063	Suplementación para PBMC/leucocitos y MSC medio completo
Suero fetal bovino (FBS)	1) Hyclone, para el cultivo de MSC, 2) Life Technologies, para todas las demás células (es decir, PBMC, poblaciones específicas de leucocitos)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Lotes de pruebas previas para el soporte del cultivo in vitro de MSC
Placa de cultivo celular de 24 pocillos	Corning	COR3524	Placa de cocultivo
Tubo de centrífuga de 50 mL	Corning	430291	Aislamiento de PBMCs a partir de sangre total de Ficoll-Paque PLUS
Tubo de centrífuga de 15 mL	Corning	430766	Recolección de las fracciones celulares marcadas y no marcadas
Tubos de fondo redondo	Halcón BD	352008	Recolección de células para análisis de citometría de flujo