Una investigación de flujo in vitro del efecto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos

Resumen

Fuente: Munir, H. et al., Análisis de los efectos de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos del flujo. J. Vis. Exp.(2015)

El video muestra un método para investigar el impacto de las células estromales en el reclutamiento de leucocitos. En un modelo de cámara de flujo de placas paralelas, las citocinas proinflamatorias inducen la expresión de receptores de adhesión por parte de las células endoteliales, lo que facilita el reclutamiento y la migración de neutrófilos. La diafonía entre las células estromales y las células endoteliales disminuye el reclutamiento de neutrófilos a las células endoteliales.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales humanas primarias y células madre mesenquimales

1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC):
   1. Coloque el cordón umbilical en una bandeja con toallas de papel y rocíelo con etanol al 70%. Colóquelo en una campana de cultivo de tejidos. Identifique la vena y la cánula en ambos extremos. Coloque una brida alrededor del extremo canulado para asegurarlo.
   2. Lave la sangre venosa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringa. Llene la jeringa con aire y pásela a través de la vena para eliminar y desechar el PBS residual.
   3. Descongelar 10 mg/ml de colagenasa tipo Ia y diluir 1:10 en PBS (con cloruro de calcio y magnesio) hasta una concentración final de 1 mg/ml. Pasar la solución de colagenasa en la vena hasta que ambas cánulas estén llenas. Cierre las pinzas de las cánulas en ambos extremos.
   4. Cubra la bandeja con un pañuelo de papel y rocíe con etanol al 70%. Coloque el cable en una incubadora durante 20 minutos a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO₂).
   5. Saque el cable de la incubadora y apriete las bridas. Masajee el cordón suavemente durante 1 min. Enjuague la suspensión celular con 10 ml de PBS y recoja en un tubo de centrífuga de 50 ml.
   6. Llene la jeringa con aire y pásela a través de la vena para eliminar cualquier PBS residual dos veces, recogiendo el PBS en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizado en el paso 1.1.5. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
   7. Aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 1 ml de medio de células endoteliales (CE) completas. El medio EC consta de M199 suplementado con 35 μg/ml de sulfato de gentamicina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano, 1 μg/ml de hidrocortisona, 2,5 μg/ml de anfotericina B y 20% de suero fetal de ternero.
   8. Añadir 4 ml de medio EC y la suspensión EC en un matraz de^{25 cm2}. Cambie el medio al día siguiente y luego cada 2 días.
   9. ECs exhibe una morfología similar a la de un adoquín (Figura 1Ai). Para los ensayos de adherencia, las CE generalmente se siembran cuando alcanzan el 100% de confluencia (ver Sección 1.4).
2. Aislamiento de células madre mesenquimales gelatinosas de Wharton (WJMSC) a partir de cordones umbilicales humanos:
   1. Aísle el MSC derivado de la gelatina de Wharton (WJMSC) de cordones umbilicales frescos o de cordones que ya se hayan utilizado para aislar la AE. Corte el cordón umbilical en trozos de 5 cm de largo. Corta cada pieza longitudinalmente para revelar los vasos sanguíneos (2 arterias [blancas, rígidas] y 1 vena [amarilla, distendida]).
   2. Con tijeras y fórceps estériles, retire los vasos sanguíneos y deséchelos. Corta todo el tejido en 2 - 3 mm³ trozos. Con pinzas, coloque³ piezas de 2 a 3 mm en un tubo de centrífuga de 50 ml.
   3. Descongelar 100 mg/ml de caldo de colagenasa tipo II y diluir 1:100 en 10 ml de PBS hasta una concentración final de 1 mg/ml. Descongelar 20.000 U/ml de caldo de hialuronidasa y diluir 1:400 hasta una concentración final de 50 U/ml en la solución de colagenasa.
   4. Agregue un cóctel enzimático al tubo de centrífuga que contiene los fragmentos de tejido. Incubar los fragmentos de tejido durante 5 horas a 37 °C en un rotador lento.
   5. Diluir la suspensión celular 1:5 en PBS. Coloque un filtro de poros de 100 μm en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Vierta la suspensión celular en el filtro de poros de 100 μm.
      nota: Los fragmentos de tejido restantes se retendrán en el filtro y las células se recogerán en el tubo de centrífuga de 50 ml.
   6. Deseche el filtro. Centrifugar la suspensión celular a 400 x g durante 10 min en RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de WJMSC en 12 ml de medio de cultivo completo de WJMSC (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM low glucose, 10% fetal ternf serum (FCS) y 100 U/ml de penicilina + 100 μg/ml de mezcla de estreptomicina).
   7. Siembre todas las células en un matraz de cultivo de tejidos de 75^cm2. Cambie el medio después de 24 horas con 12 ml de medio de cultivo WJMSC completo. Reemplace el medio cada 2 a 3 días. Las células deben alcanzar un 70-80% de confluencia en 2 semanas. Paso cuando WJMSC alcanza 70 - 80% de confluencia (ver Sección 1.4).
3. Expansión de MSC derivadas de la médula ósea (BMMSC):
   1. Aísle MSC derivado de la médula ósea humana (BMMSC) como se describió anteriormente. Añadir 10 ml de células madre mesenquimales precalentadas, medio de crecimiento MSC (MSCGM) en un tubo de centrífuga de 15 ml.
   2. Descongele un vial de p2 BMMSC colocándolo en un baño de agua a 37 °C durante 2 min. Agregue la suspensión de BMMSC al tubo de centrífuga que contiene MSCGM. Mezclar bien pipeteando.
   3. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a RT. Aspirar el sobrenadante completamente.
   4. Vuelva a suspender las células en 1 ml de MSCGM y cuente las células con un hemocitómetro o un contador de células digital, como un celómetro.
   5. Siembra las células en matraces de cultivo de 75^cm2 a una densidad de 5.000 - 6.000 células por^cm2 en MSCMG de 12 ml. Cambie el medio después de 24 horas con 12 ml de MSCGM. Alimente las células con 12 ml de MSCGM cada 2 a 3 días.
   6. Paso cuando BMMSC alcanza el 70 - 80% de confluencia (ver Sección 1.4). Las células exhiben una morfología fibroblástica (Figura 1Aii).
4. Desprendimiento de EC y MSC:
   1. Aspirar medio a partir de^{25 cm 2} matraces de cultivo. Añadir 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,02% durante aproximadamente 2 min. Aspirar EDTA y añadir 2 ml de tripsina (2,5 mg/ml). Observar bajo el microscopio hasta que las células se vuelvan redondas.
   2. Golpee el matraz para separar las celdas. Inactivar la tripsina añadiendo 8 ml de medio de cultivo (dependiendo del tipo de célula; EC para HUVEC, DMEM LG para WJMSC y MSCGM para BMMSC) al matraz de cultivo y transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 ml.
   3. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a RT. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet como se describe a continuación.
      1. Para el paso de MSC, vuelva a suspender el pellet en un medio de cultivo de 3 ml. Añadir 11 ml de medio de cultivo en tres matraces de cultivo de^{75 cm 2} separados. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada matraz de cultivo (1:3 split). Pase WJMSC y BMMSC 3 veces (p3) antes de su uso en ensayos de cocultivo.
      2. Para la siembra de EC o MSC en ensayos de adhesión, véanse las secciones 2 y 3.
5. Congelación de MSC:
   1. En el pasaje 3, separe MSC como se describe en la Sección 1.4. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 3 ml de CryoSFM helado. Pipetear 1 ml de alícuotas de suspensión celular en crioviales helados de 1,5 ml. Coloque los crioviales en un recipiente para congelar.
   2. Guarde el recipiente a -80 °C O/N. Transfiera a nitrógeno líquido. Descongele un vial de MSC (siga los pasos 1.3.1 - 1.3.6). Vuelva a suspender MSC en un medio de cultivo de 5 ml (elija el medio apropiado para WJMSC o BMMSC) y siembre en un matraz de 25^cm2.

>2. Establecimiento de cocultivos de células madre endoteliales-mesenquimales en filtros

1. Desconecte WJ o BMMSC como se describe en la Sección 1.4. Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de MSCGM. Realice un recuento de células utilizando un hemocitómetro o un celómetro.
2. Ajuste el volumen para que la concentración final sea de 5 x 10^{5 MSC} en 500 μl de MSCGM.
3. Con pinzas estériles, invierta los filtros PET Transwell de 6 pocillos y 0,4 μm y colóquelos en una caja estéril.
4. Siembre 5 x 10^{5 MSC} en la superficie exterior de los filtros. Incubar filtros a 37 °C y 5% de CO₂ durante 1 hora.
5. Recoja los medios de la superficie exterior del filtro. Cuente el número de MSC no adherentes en los medios. Vuelva a invertir los filtros con pinzas estériles y colóquelos en una placa de 6 pocillos correspondiente que contenga 3 ml de MSCGM.
6. Agregue 2 ml de MSCGM en la superficie interna del filtro (Figura 1B). Colocar en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 horas. Tripsinizar un matraz confluente de 25^cm2 de EC (Figura 1Ai; como Sección 1.4).
7. Vuelva a suspender EC en MSCGM de 8 ml (1 matraz de^{25 cm 2} sembrará cuatro filtros de 6 pocillos; ~5 x 10⁵ EC / filtro). Aspire el medio desde la parte superior e inferior de los filtros porosos. Agregue 3 ml de MSCGM fresco en la cámara inferior (debajo del filtro). Añadir 2 ml de suspensión EC en la superficie interior de cada filtro. Incubar durante 1 hora a 37 °C y 5% de_CO2.
8. Aspire el medio para lavar la AE no adherente y reemplácela con MSCMM fresco. Configure filtros de monocultivo EC paralelos mediante la siembra de células en la superficie interna sin sembrar primero MSC. Incubar O/N a 37 °C y 5% de_CO2.
9. Compruebe que la monocapa EC sea confluente y no contenga huecos. Las monocapas subconfluentes no se pueden utilizar para ensayos de adhesión (Figura 1B).
10. Descongele 1 x 10⁵ U/ml de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y diluya 1:1.000 en MSCGM hasta una concentración final de 100 U/ml (equivalente a ~10 ng/ml). Realizar una dilución en serie diluyendo 100 U/ml de TNFα en 1:10 en MSCGM para obtener 10 U/ml. Diluir 10 U/ml de TNFα en 1:10 en MSCGM para obtener 1 U/ml.
11. Tratar las cámaras superior e inferior de los filtros con 1, 10 o 100 U/ml de TNFα (equivalente a ~10 ng/ml) a 37 °C durante 4 horas antes del ensayo.

>3. Aislamiento de leucocitos

1. Tome sangre venosa de voluntarios sanos y alícuota inmediatamente en tubos de EDTA. Invierta los tubos suavemente para mezclar.
2. Aplique 2,5 ml de Histopaque 1077 sobre 2,5 ml de Histopaque 1119 en un tubo de fondo redondo de 10 ml. Coloque 5 ml de sangre entera en el gradiente histopaca. Centrífuga a 800 x g durante 40 min a RT.
3. Recolección de neutrófilos polimorfonucleares periféricos (PMN) en la interfaz de Histopaque 1077 y 1119 (por encima de la capa de eritrocitos). Colocar en un tubo de fondo redondo de 10 ml y maquillar hasta 10 ml con PBSA. Invierta suavemente el tubo y centrifugue a 400 x g durante 5 min en RT.
4. Diluir la solución de BSA al 7,5% 1:50 en 100 ml de PBS (con cloruro de calcio y magnesio) hasta una concentración final del 0,15% (p/v; PBSA). Aspirar sobrenadante y resuspender en 10 ml de PBSA. Centrifugar a 400 x g durante 5 min en RT.
5. Volver a suspender en 1 ml de PBSA. Tome una alícuota de 20 μl de la suspensión celular y agregue a 380 μl de PBSA (dilución 1:20). Cuente las células con un hemocitómetro o un celómetro. Diluir hasta la concentración requerida (1 x 10⁶/ml para filtros Transwell y microportaobjetos Ibidi) en PBSA. Mantener la suspensión de neutrófilos en RT hasta el ensayo.

>4. Montaje del sistema de flujo

1. Configure el sistema de flujo como se muestra en la Figura 1C. Encienda el calentador y ajústelo a 37 °C. Coloque una jeringa de 20 ml (retire el émbolo) y una jeringa de 5 ml en un grifo de 3 vías. Fije el grifo a la cámara de metacrilato con cinta Micropore.
2. Mida y corte un trozo largo de tubo de silicona de 2/4 mm (de grosor) que sea aproximadamente la distancia entre la válvula y el grifo de 3 vías. Corte un trozo de tubo de 1/3 mm (fino) de 8 a 10 mm de largo e insértelo en un extremo del tubo grueso. Fije el lado del tubo grueso en el grifo de 3 vías.
3. Conecte el extremo del tubo delgado a un puerto de la microválvula electrónica de 3 vías. Este es el "depósito de lavado". Corta un trozo de tubo grueso y fino de 6 a 8 mm de largo.
4. Inserte el tubo delgado en un extremo del tubo grueso. Conecte el extremo del tubo grueso a una jeringa de 2 ml (retire el émbolo).
5. Conecte el extremo del tubo delgado de la jeringa de 2 ml a un puerto de la microválvula electrónica para hacer el "depósito de muestra". Conecte la válvula a la cámara de flujo del filtro midiendo y cortando un trozo largo de tubo delgado que es la distancia entre la microválvula y el centro de la etapa del microscopio.
6. Para el modelo de microportaobjetos, conecte un trozo de tubo grueso de 8 a 10 mm al extremo del tubo delgado. Coloque un conector en forma de L en el extremo del tubo grueso. Esto se conectará al microportaobjetos. Para el modelo de filtro, conecte una pieza de manómetro Portex Blue Line de 8 a 10 mm conectando el tubo al extremo del tubo delgado.
7. Coloque el extremo del tubo delgado en la microválvula. Esta es la salida común para los depósitos de lavado y muestra. Llene los depósitos con PBSA. Prepare los tubos haciendo fluir PBSA a través de ellos para eliminar las burbujas de aire.
8. Conecte el tubo del manómetro a una jeringa de vidrio de 29 mm (50 ml). Prepare la jeringa llenándola con 10 ml de PBSA. Invierta la jeringa de modo que el extremo conectado al tubo mire hacia arriba y expulse todas las burbujas de aire. Rellene con 5 ml de PBSA.
9. Solo para el modelo de microportaobjetos, conecte un trozo de tubo grueso de 10 a 12 mm al extremo del tubo del manómetro que conduce a la jeringa de vidrio. Coloque un conector en forma de L en el extremo del tubo grueso. Coloque la jeringa de vidrio en una bomba de jeringa para la infusión/extracción.
10. Calcule el caudal de relleno (Q) necesario para generar el esfuerzo cortante de pared deseado (τ_w en Pascal, Pa) de 0,1 Pa (filtros Transwell) o 0,05 Pa (microportaobjetos Ibidi) utilizando las siguientes fórmulas:
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    Donde w = ancho interno y h = profundidad interna del canal de flujo. n = viscosidad de la solución que fluye; PBSA es n = 0,7 mPa.s. Para la cámara de flujo del filtro de placa paralela, el ancho (w) es de 4 mm y la profundidad (h) es de 0,133 mm. La profundidad de la cámara puede variar ligeramente debido a las diferencias en el grosor de la junta Parafilm utilizada. Para el microportaobjetos Ibidi, el ancho es de 3,8 mm y la profundidad es de 0,4 mm.
    nota: Debido a las diferencias en las dimensiones del canal de flujo y la dinámica de captura, utilizamos diferentes esfuerzos cortantes para el modelo de microdeslizamiento en comparación con el modelo de filtro.

>5. Configuración de la cámara de flujo de placas paralelas que incorpora filtros

1. Corta un pedazo de Parafilm (del mismo tamaño que el cubreobjetos de vidrio) usando una plantilla de metal. Corta una ranura de 20 x 4 mm en el Parafilm (para crear el canal de flujo) con una plantilla de metal. Utilice la junta para marcar el canal de flujo en el cubreobjetos de vidrio.
2. Alinee los bordes del filtro de 6 pocillos en el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el filtro cubra las marcas del canal de flujo. Corta con cuidado el filtro con un bisturí tipo 10A.
3. Cubra cuidadosamente el filtro con una junta de Parafilm, asegurándose de que la ranura del canal de flujo esté en el medio del filtro (Figura 1D). Use un pedazo de papel limpio y expulse las burbujas.
4. Coloque el cubreobjetos en el hueco de la placa inferior de la cámara de flujo de metacrilato. Coloque la placa superior de metacrilato sobre la parte superior de la junta y atornille las placas (Figura 1D).
5. Gire el grifo de 3 vías para permitir que el tampón de lavado (PBSA) fluya a través de la válvula. Conecte el tubo del manómetro al puerto de entrada de la placa de metacrilato superior. Ejecute PBSA a través del canal de flujo para permitir que pasen las burbujas.
6. Conecte el tubo del manómetro de la bomba de jeringa al puerto de salida de la placa de metacrilato. Configure la bomba de jeringa para que se llene y presione ejecutar. Limpie cualquier PBSA que haya goteado sobre la placa superior de la cámara.
7. Coloque la cámara en la platina de un microscopio de contraste de fase invertida. Ajuste el enfoque para visualizar la EC por encima de los filtros (Figura 1B).

>6. Perfusión de leucocitos sobre células endoteliales

1. Introducir 2 ml de neutrófilos purificados en el depósito de muestra y dejar calentar durante 2 min. Lavar el endotelio con PBSA durante 2 min.
2. Abra la válvula para perfundir neutrófilos sobre el endotelio. Administre el bolo de neutrófilos durante 4 min. Apague la válvula y perfunja PBSA del depósito de lavado durante el resto del experimento.
3. Asegúrese de que las burbujas de aire no pasen a través del canal de flujo en ningún punto durante el ensayo, ya que esto interrumpirá la monocapa de EC y provocará el desprendimiento de los neutrófilos adherentes.

>7. Registro de la captura y el comportamiento de los neutrófilos

1. Registre el reclutamiento de neutrófilos durante el flujo de neutrófilos o después de la perfusión.
2. Realice todas las grabaciones digitales de al menos 5 a 10 campos en el centro del canal de flujo. Identifique el centro del canal moviendo el objetivo al borde del canal en el puerto de entrada e identificando el centro del puerto.
   1. Para grabar durante el flujo de neutrófilos, tome imágenes de un solo campo cada 10 segundos durante 1 minuto. Desplácese a lo largo del canal y grabe otro campo durante 1 minuto. Repita durante la duración del bolo.
   2. Para registrar la posperfusión, realice grabaciones de 10 segundos de 5 a 10 campos en el centro del canal de flujo para evaluar el comportamiento de los leucocitos (generalmente 2 minutos después del final del bolo de neutrófilos). Tome imágenes cada segundo dentro del intervalo de 10 segundos. Esto permite tiempo suficiente para la captura del flujo y el análisis del comportamiento de los neutrófilos adherentes.
   3. Registre un solo campo que contenga al menos 10 neutrófilos transmigrados durante 5 minutos, tomando imágenes cada 30 segundos. Esto se puede utilizar para calcular la velocidad de las células migradas (ya sea por encima o por debajo del endotelio).
   4. Registre otra serie de campos de 10 segundos (generalmente 9 minutos después de la perfusión). Esto permite que los neutrófilos migren a través de la monocapa endotelial.
   5. Detenga la bomba de jeringa y retire el tubo. Desmonte la cámara de flujo y enjuague el depósito de muestra y la tubería. Repita el procedimiento para los siguientes filtros/canales de microdiapositivas.

>8. Análisis del reclutamiento y comportamiento de los leucocitos

1. Cuente el número de neutrófilos en cada campo durante las grabaciones de 10 segundos en el punto de tiempo de 2 minutos. Todas las celdas deben estar presentes en el primer campo del segundo para que se cuenten. Las celdas que están parcialmente en el campo en 2 lados (por ejemplo, el borde superior/derecho) del campo de visión se incluyen en los recuentos, siempre y cuando permanezcan en el campo durante los 10 segundos completos.
2. Calcular el número medio de neutrófilos adherentes por campo. Mida la longitud y el ancho del campo registrado. Calcula el área del campo. Calcule cuántos campos hay en 1 mm². Multiplique el recuento medio de neutrófilos por el número de campos en 1 mm².
3. Calcule el número total de neutrófilos perfundidos multiplicando la cantidad de neutrófilos perfundidos (p. ej., 2 x 10⁶/ml*Q [p. ej., 0,0999 ml/min para la cámara de flujo de placa paralela]) por la duración del bolo (p. ej., 4 min).
4. Divida el recuento de neutrófilos/^mm2 por el número total de neutrófilos perfundidos para determinar el número total de células que se han adherido (células adherentes/mm² / 10,⁶ perfundidas).
5. Evaluar si los neutrófilos adherentes están rodando, firmemente adheridos o transmigrados.
   1. Un neutrófilo rodante es brillante en fase y se moverá lentamente a lo largo de la monocapa endotelial (1 - 10 μm/seg).
   2. Las células firmemente adheridas son brillantes en fase y están unidas a la superficie de la CE, ya sea permaneciendo estacionarias (es decir, sin moverse durante el registro) o han sufrido un cambio de forma y están migrando sobre la superficie de la CE (Figura 1Ei).
   3. Un neutrófilo transmigrado está en fase oscura y por debajo de la capa EC (Figura 1Eii).
6. Calcule el porcentaje de células adherentes que son rodantes, estacionarias y transmigradas. Alternativamente, el comportamiento de los neutrófilos se puede expresar como el número total de células que exhiben los diferentes comportamientos aplicando la misma fórmula utilizada para calcular la adhesión total (como se describe en los pasos 8.6 - 8.7).
   1. Marca el borde delantero de un neutrófilo rodante. Marque el borde inicial de la misma celda al final de la secuencia de 10 segundos. Dibuja una línea entre los 2 puntos y mide la distancia que ha recorrido la celda.
   2. Divida este valor por la duración de la grabación en la que la celda está rodando (es decir, 10 segundos). Intente seleccionar los neutrófilos que estén en el campo durante todo el intervalo de 10 segundos.
7. Para calcular la velocidad de los neutrófilos que migran sobre la superficie (fase cambiada con forma, brillante) o por debajo del endotelio (fase oscura), utilice el registro de 5 minutos.
   1. Dibuje un contorno de las células migradas al principio de la secuencia y siga sus movimientos a lo largo de la secuencia. Tome nota de las posiciones X e Y del centroide en cada intervalo de 1 minuto para cada celda. Reste los valores de las posiciones X e Y de la primera imagen de la secuencia de los valores de la segunda imagen. Esto se basa en el teorema de Pitágoras.
   2. Reste los valores de la segunda imagen de la tercera imagen. Haga esto para todas las imágenes de la secuencia. Eleva al cuadrado los valores X e Y y súmalos.
   3. Raíz cuadrada del valor resultante. Calcule la velocidad de cada celda promediando las velocidades calculadas en cada intervalo de minutos. Rastrea 10 neutrófilos migrados y calcula la velocidad media.

Resultados

Figura 1. Establecimiento del cocultivo EC-MSC y análisis del reclutamiento de neutrófilos mediante un ensayo de adhesión basado en flujo. (A) Micrografía de (i) EC primario y (ii) paso 3 BMMSC cultivados en matraces de cultivo de tejidos. (B) Micrografía de EC y MSC cultivadas en insertos de filtro Transwell de 6 pocillos. (C) Diagr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colagenasa tipo Ia	sigma	C2674	Diluir en 10 ml de PBS para obtener una concentración final de 10 mg/ml. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 1 ml.
PBS de Dulbecco	sigma	D8662	Con cloruro de calcio y magnesio. Manténgalo estéril y guárdelo a temperatura ambiente.
1X Medio M199	Gibco	31150-022	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar.
Sulfato de gentamicina	sigma	G1397	Conservar a 4°C. Añadir a la botella M199 de 500 ml.
Factor de crecimiento epidérmico humano	sigma	E9644	Almacenar a -20 °C en alícuotas de 10 μl.
Suero fetal de ternera (FCS)	sigma	F9665	El FCS debe someterse a pruebas por lotes para garantizar el crecimiento y la viabilidad de la CE aislada. Inactivación por calor a 56 °C. Almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 °C.
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Potente y se vuelve tóxico en una semana, por lo que el medio HUVEC completo y fresco debe reponerse cada semana. Conservar a -20°C en alícuotas de 1 ml.
hidrocortisona	sigma	H0135	Las existencias son de etanol. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 10 μl.
Colagenasa Tipo II	sigma	C6885	Diluir el caldo en PBS hasta una concentración final de 100 mg/ml. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 100 μl.
hialuronidasa	sigma	H3631	Diluir el caldo en PBS hasta una concentración final de 20.000 U/ml. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 100 μl.
Filtro de células de 100 μm para tubo de centífugo de 50 ml	Suministros de laboratorio científico (SLS)	352360	También se pueden utilizar otros filtros celulares disponibles en el mercado (por ejemplo, Greiner bio-one).
DMEM glucosa baja	Biosera	LM-D1102/500	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar.
Mezcla de penicilina/estreptomicina	sigma	P4333	Conservar a -20°C en alícuotas de 1 ml.
Matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2	Sls	353109
Matraz de cultivo de tejidos de 75cm2	Sls	353136
Vial de células madre mesenquimales de médula ósea	Lonza	PT-2501	Almacene en nitrógeno líquido a su llegada. Las celdas están en el pasaje 2 a su llegada, pero están designadas como pasaje 0. Explique al pasaje 3 y almacene en nitrógeno líquido para su uso posterior.
Medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar. Para la tinción Cell Tracker Green, use medio sin FCS.
Solución EDTA (0.02%)	sigma	E8008	Conservar a 4 °C. Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar.
Solución de tripsina	sigma	T4424	Conservar a -20°C en alícuotas de 2 ml. Descongele a temperatura ambiente y úselo inmediatamente.
Crioviales	Greiner bio-one	2019-02	Manténgalo en hielo antes de agregar antes de agregar la suspensión celular.
Contenedor de congelación Mr. Frosty	Nalgene	5100-0001	Almacene a temperatura ambiente. Al agregar crioviales con células, almacene a -80 °C durante 24 horas antes de transferir las células a nitrógeno líquido.
Tinte verde rastreador de células	Tecnologías para la vida	C2925	Almacenar en alícuotas de 5 μl a -20 °C. Diluir en 5 ml de MSCMM precalentado (a 37 °C).
Cámaras de recuento de células	Nexcelom	SD-100	Alternativamente, se puede utilizar un hemocitómetro.
Celómetro automático Contador de células T4	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Factor de necrosis tumoral α (TNFα)	Sistemas de investigación y desarrollo	210-TA-100	Diluir el caldo en PBS hasta una concentración final de 100.000 U/ml. Almacenar a -80 °C en alícuotas de 10 μl.
Filtros Transwell de PET de 6 pocillos y 0,4 μm	Sls	353090
K2-EDTA en tubos de 10 ml	Sarstedt		Almacene a temperatura ambiente.
Histopaque 1119	sigma	11191	Almacenar a 4 °C. Calentar a temperatura ambiente antes de usar.
Histopaco 1077	sigma	10771	Almacenar a 4 °C. Calentar a temperatura ambiente antes de usar.
Tubo de fondo redondo de 10 ml	Bosques de Appleton	SC211 142 COMO
Solución de fracción V de BSA al 7,5 %	Tecnologías para la vida	15260-037	Conservar a 4°C.
Jeringas Plastipak de 20 ml	Halcón BD	300613
Jeringas Plastipak de 5 ml	Halcón BD	302187
Jeringas Plastipak de 2 ml	Halcón BD	300185
Cinta quirúrgica hipoalergénica 3M 9m x 2,5cm	microporo	1530-1	Úselo para asegurar el grifo de la jeringa en la pared de la cámara de metacrilato.
Tubo de caucho de silicona, diámetro interno/diámetro externo (ID/OD) de 1/3 mm (tubo delgado)	Fisher Científico	FB68854	Corte el tubo de silicona al tamaño adecuado. Todos los tubos que conducen directamente a la microválvula electrónica deben ser delgados.
Tubo de caucho de silicona ID/OD de 2/4 mm (tubo grueso)	Fisher Científico	FB68855
Tubo de manómetro Portex Blue Line	Smiths	200/495/200	Tubo que conduce a la bomba de jeringa.
Llave de paso de 3 vías	BOC Ohmeda AB
Jeringa de vidrio de 50 ml para bomba	Popper Micromate	550962	Debe imprimarse antes de su uso eliminando las burbujas de aire.
Cubreobjetos de vidrio	Raymond Un cordero		Cubreobjetos de 26x76mm hechos por encargo. Número de lote 2440980.
Junta de parafilm	Compañía Nacional Americana de Latas		Corte una pieza de parafilm de 26x76 mm con una plantilla de aluminio y corte una ranura de 20x4 mm con un bisturí 10a. El grosor de la junta es de aproximadamente 133 μm.
Dos placas paralelas de metacrilato	Laboratorio de Tecnología Aplicada Wolfson		Cámara especialmente diseñada que consta de placas paralelas unidas por 8 tornillos. La placa inferior tiene una ranura de visualización recortada en el medio y un hueco poco profundo fresado para dejar espacio para el cubreobjetos, el filtro y la junta. La placa superior de metacrilato tiene un orificio de entrada y salida colocado sobre el canal de flujo.
Microválvula electrónica de 3 vías con espacio muerto mínimo	Lee Productos Ltd.	LFYA1226032H	Conectado electrónicamente a una fuente de alimentación de 12 voltios CC.
Bomba de jeringa para perfusión/extracción (PHD2000)	Aparato de Harvard	70-2001	Ajuste el diámetro a 29 mm y la tasa de recarga (flujo).
Conector en forma de L	Labhut	LE876	Para acoplar a los puertos de entrada y salida en el canal de microcorredera Ibidi.
Cámara de video	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Conectado a un ordenador que permite grabar vídeos digitall.
Imagen-Pro Plus 7.0	Cibernética de los medios de comunicación	41N70000-61592	Para el análisis de datos. Etiquete manualmente las celdas mostrando los diferentes comportamientos. Células de seguimiento para el análisis de las velocidades de rodadura y migración.