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>1. Inducción de senescencia por fármacos quimioterapéuticos en células cancerosas cultivadas
NOTA: Todos los pasos de manipulación celular de esta sección deben realizarse en una cabina de bioseguridad utilizando prácticas estériles. Esta sección está escrita para los tipos de células adherentes. Las celdas de suspensión se pueden usar con las modificaciones apropiadas como se indique.
- Cultive líneas celulares cancerosas de acuerdo con el protocolo estándar del proveedor o del laboratorio que proporcionó la(s) línea(s) celular(es) específica(s) utilizada(s).
nota: Por lo general, se prefieren las células de paso bajo (p < 10), ya que habrá niveles más bajos de senescencia replicativa, es decir, un fondo más bajo, en las muestras de células no tratadas.
- Un día antes de la inducción de la senescencia por fármacos, recoja las células con tripsina-EDTA al 0,25% (o según se recomiende). Neutralice la tripsina agregando un volumen igual de medio de cultivo completo y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico estéril.
nota: Este paso no es necesario para las celdas de suspensión.
- Cuente las células utilizando el método estándar del hematocitómetro y registre las células/mL. Células en placa a 1 × 103-10 ×10 3 células/cm2 en placas de cultivo de plástico estándar de 6 pocillos.
nota: La densidad óptima de siembra depende de la tasa de proliferación de las células y debe ser determinada por el usuario. Las células deben estar en fase de crecimiento logarítmico con una confluencia de aproximadamente el 10%-20% en el momento del tratamiento (es decir, después de 18-24 h de incubación después de la siembra). La densidad inicial (células/mL) de las células de suspensión debe ser determinada por el usuario. Las placas de seis pocillos suelen producir suficientes células senescentes por pocillo para una muestra de análisis de citometría de flujo estándar. Si se trata de una clasificación por flujo, se debe utilizar una superficie mucho mayor (por ejemplo, varias placas P150) para permitir la recuperación de un número suficiente de células senescentes para los ensayos posteriores (≥1 × 106).
- Incubar las células sembradas durante la noche (18-24 h) en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 y una bandeja de humedad.
- Tratar las células placalizadas con fármacos quimioterapéuticos inductores de la senescencia. Incluya al menos un control positivo, por ejemplo, etopósido (ETO) o bleomicina (BLM). Prepare pocillos duplicados por medicamento. Incluya un conjunto tratado con vehicle-only como control.
nota: El usuario debe probar una curva de dosis para cada agente experimental a fin de determinar la concentración óptima para la inducción de la senescencia en la(s) línea(s) celular(es) utilizada(s).
- Incubar las células durante 4 días en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y una bandeja de humedad para permitir el inicio de la senescencia. Examine diariamente los cambios morfológicos esperados utilizando un microscopio óptico.
nota: Los tiempos de incubación de 3 a 5 días pueden ser aceptables dependiendo de la tasa de inicio de la senescencia. Se pueden cambiar los medios y volver a aplicar el agente (o no), según se desee, para promover condiciones de crecimiento saludables mientras se logra un porcentaje aceptable de células senescentes.
- Tras el inicio de la senescencia, recoja las células añadiendo tripsina-EDTA al 0,25% durante 5 min a 37 °C. Cuando las células se disocian en suspensión, neutralice la tripsina con un volumen igual de medio completo.
nota: Este paso no es necesario para las células que crecen en suspensión. Si se va a llevar a cabo la tinción de marcadores de superficie, evite el uso de tripsina-EDTA, ya que puede destruir temporalmente los antígenos de superficie en las células. En su lugar, disocie suavemente la monocapa con un raspador de células de plástico estéril (o un reactivo de disociación alternativo diseñado para preservar los antígenos de superficie).
- Cuente las células de cada muestra con un hematiómetro. Calcule las células/mL para cada muestra.
nota: Se puede agregar azul de tripano para evaluar el porcentaje de células muertas en este punto (es decir, debido al tratamiento con medicamentos), pero la muerte celular también se determinará con un tinte fluorescente de viabilidad durante el flujo de trabajo de tinción DDAOG.
- Alícuota ≥0,5 × 106 células por muestra en tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.
nota: El número de células por muestra debe estandarizarse en todas las muestras.
- Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 × g en una microcentrífuga a 4 °C. Retirar el sobrenadante.
nota: Si no se dispone de una microcentrífuga refrigerada, puede ser aceptable realizar centrifugaciones a temperatura ambiente para ciertos tipos de células resistentes.
- Proceda a la tinción DDAOG en la sección 2.
>2. Tinción DDAOG de SA-β-Gal en muestras celulares
- Diluir 1 mM de bafilomycin A1 a 1:1.000x en medio DMEM (sin FBS) hasta obtener una concentración final de 1 μM.
- Añada la solución preparada de Baf-DMEM a las muestras de pellets de células (a partir del paso 1.11) para una concentración de 1 × 106 células/mL.
nota: Por ejemplo, si utiliza 0,5 × 106 células por muestra, añada 0,5 ml de Baf-DMEM.
- Incubar durante 30 min a 37 °C (sin CO2) en un rotador/agitador ajustado a baja velocidad.
nota: Evite las incubadoras de CO2 para el proceso de tinción, que pueden acidificar las soluciones y, por lo tanto, interferir con la tinción de Baf y DDAOG.
- Sin lavar, añadir la solución madre DDAOG (5 mg/mL) a 1:500x (10 μg/mL final) a cada muestra. Pipeta para mezclar. Reemplácelo en un rotor/agitador a 37 °C (sin CO2) durante 60 min. Proteger de la luz directa.
- Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C. Retirar el sobrenadante.
- Lavar con 1 mL de BSA 0,5% frío como hielo por tubo y pipetear para mezclar. Centrifugar los tubos durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C y eliminar el sobrenadante. Repita este paso 2 veces para lavar a fondo las células. Retire el sobrenadante y proceda.
nota: Es importante realizar los pasos de lavado del paso 2.6 para eliminar el DDAOG desordenado, que puede presentar una emisión de fluorescencia no deseada (460/610 nm).
- (Opcional) Fijación y almacenamiento de células teñidas con DDAOG para su posterior análisis
- Agregue 0,5 mL de paraformaldehído al 4% helado gota a gota a cada muestra lavada. Pipeta para mezclar.
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lave las células 2 veces con 1 mL de PBS.
- Almacene las muestras hasta 1 semana a 4 °C antes del análisis de citometría de flujo.
nota: En el caso de las muestras fijas, omita el paso 2.8.
- Diluir el stock Calcein Violet 450 AM (1 mM) a 1:1.000x en 1% BSA-PBS (1 μM final). Añada 300 μL (para muestras de células cultivadas) a los gránulos de células lavadas del paso 2.6. Incubar durante 15 minutos en hielo en la oscuridad.
- Proceda a la configuración de la citometría de flujo (sección 3).
>3. Configuración del citómetro de flujo y adquisición de datos
- Transfiera las muestras celulares a tubos compatibles con el instrumento de citometría de flujo. Coloque los tubos sobre hielo y manténgalos protegidos de la luz.
nota: Si se observan agregados en las suspensiones celulares, pase la suspensión a través de filtros celulares de 70-100 μm antes del análisis. No utilice filtros de 40 μm porque pueden excluir algunas de las células senescentes más grandes.
- En el software referenciado (consulte la Tabla de Materiales), abra los siguientes gráficos: 1) Diagrama de puntos FSC-A vs SSC-A, 2) Histograma de canal violeta, 3) Diagrama de puntos de canal rojo lejano (por ejemplo, APC-A) versus canal verde (por ejemplo, FITC-A).
nota: También se pueden utilizar gráficos de exclusión de dobletes e histogramas de un solo canal, pero no son estrictamente necesarios.
- Inicie la adquisición de datos del citómetro.
- Coloque la muestra de control solo para vehículos teñida con DDAOG en el puerto de admisión. A una velocidad de admisión baja, comience a adquirir datos de muestra.
- Ajuste los voltajes FSC y SSC para que el >90% de los eventos estén contenidos dentro de la parcela. Si las celdas no encajan bien en el gráfico, baje la configuración de escala de área a 0,33-0,5 unidades.
- Retire la muestra solo del vehículo sin registrar datos.
- (Opcional) Agregue una gota de microesferas de calibración arco iris a un tubo de citómetro con 1 mL de PBS. Coloque el tubo en el puerto de entrada del citómetro. Comience a adquirir datos de muestra.
- Ajuste los voltajes de los canales violeta, verde y rojo lejano para que el pico superior de la microesfera del arco iris esté en el rango de 104-105 unidades de fluorescencia relativa en cada canal y todos los picos estén bien separados en cada canal. Récord de 10.000 eventos. Retire el tubo.
- Coloque la muestra de control positivo (p. ej., BLM, ETO) teñida con DDAOG en el puerto de admisión. A baja velocidad, adquiera datos de muestra. Observe los eventos en los canales FSC, SSC, violeta, verde y rojo lejano para asegurarse de que más del 90% de los eventos estén contenidos en todas las parcelas. Busque un aumento en la señal AF y DDAOG en comparación con el control solo del vehículo.
- Si utiliza un citómetro de clasificación, inicie la clasificación en este paso.
- Con fines de registro, registre 10.000 celdas para la muestra de control y cada muestra clasificada.
- Clasifique la cantidad deseada de células (≥1 ×10 6 suele ser adecuada) en un tubo de recolección apropiado para el instrumento con 3-5 mL de medio de cultivo.
- Después de la clasificación, proceda a la referencia cultural o al análisis.
nota: Para el citómetro de flujo calibrado utilizado en este documento, los voltajes óptimos de los canales generalmente cayeron entre 250 y 600 (rango medio), pero los voltajes óptimos y los rangos de voltaje de los canales variarán según los instrumentos. Evite usar voltajes en rangos muy bajos o altos, ya que pueden suprimir la señal o amplificar el ruido.
- Después de completar los pasos 3.1-3.5 y realizar los ajustes necesarios en la configuración del citómetro, registre los datos de todas las muestras. Asegúrese de que los ajustes permanezcan uniformes para todas las grabaciones de muestra. Registre ≥10.000 eventos por muestra de célula cultivada.
nota: Aunque la compuerta y el análisis se pueden realizar utilizando un software de adquisición de datos (por ejemplo, FACSDiva), en la sección 4 a continuación se describe un flujo de trabajo completo de compuerta y análisis que se llevará a cabo después de la adquisición utilizando un software de análisis separado (FlowJo). Es preferible el análisis posterior a la adquisición para reducir el tiempo en la estación de trabajo del citómetro y aprovechar las herramientas adicionales incluidas en el software de análisis dedicado.
- Guarde los datos de muestra en formato de archivo .fcs. Exporte los archivos a una computadora de estación de trabajo equipada con software de análisis de citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo).
>4. Análisis de datos de citometría de flujo
NOTA: El flujo de trabajo presentado utiliza el software FlowJo. Se puede utilizar un software alternativo de análisis de datos de citometría de flujo si se siguen de manera similar los pasos clave descritos en esta sección.
- Con el software FlowJo, abra los archivos de datos .fcs del paso 3.7.
- Abra la ventana de diseño.
- Arrastre y suelte todas las muestras en la ventana de diseño.
- Células viables de puerta.
- En primer lugar, haga doble clic en los datos de muestra del control solo vehículo para abrir su ventana de datos.
- Visualice los datos como un histograma de canal violeta. Identifique las células viables teñidas por CV450 en función de su fluorescencia más brillante que las células muertas.
- Dibuje una puerta con la herramienta de histograma de puerta única para incluir solo células viables. Nombra la puerta viable.
- A continuación, desde la ventana de diseño de muestra, arrastre la puerta viable a las otras muestras de celda para aplicar la puerta de manera uniforme.
- En la ventana de presentación, visualice todas las muestras como histogramas de canal violeta (viabilidad). Verifique que la activación de células viables sea adecuada en todas las muestras antes de continuar; De lo contrario, realice los ajustes necesarios.
nota: La tinción de viabilidad puede presentar variaciones entre los tratamientos.
- Células senescentes de puerta.
- Haga doble clic en los datos de la celda viable cerrada para el control de solo vehículo para abrir su ventana de datos.
- Visualice los datos como un diagrama de puntos para el canal rojo lejano (DDAOG) frente al canal verde (AF).
- Dibuje una puerta con la herramienta de compuerta rectangular para incluir el <5% de las celdas que son DDAOG+ y AF+ (cuadrante superior derecho). Nombra la puerta senescente.
- A continuación, desde la ventana de diseño de muestra, arrastre la puerta senescente a los subconjuntos viables de las otras muestras de células para aplicar la puerta de manera uniforme.
- En la ventana de diseño, arrastre y suelte todos los subconjuntos de celdas viables activados en la sección 4.4. Visualice todas las muestras viables como diagramas de puntos de color rojo lejano (p. ej., APC-A) frente a diagramas de puntos de canal verde (p. ej., FITC-A).
- Asegúrese de que la puerta senescente dibujada en el paso 4.5.3 sea visible en todas las parcelas y que la puerta para el control solo del vehículo exhiba ≤5%-10% de células senescentes.
- Una vez que se haya determinado el porcentaje de células senescentes siguiendo los pasos anteriores, presente los datos resultantes utilizando los gráficos FlowJo, resumidos en una tabla de datos, y/o analizados estadísticamente utilizando un software estándar.