Detección de contaminación bacteriana mediante nanosensores magnetofluorescentes

Resumen

Fuente: Shelby, T., Sulthana, S., McAfee, J., Banerjee, T., Santra, S. Detección de patógenos transmitidos por los alimentos mediante nanosensor magnetofluorescente: detección rápida de E. coli O157:H7. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra una técnica para detectar contaminantes bacterianos en muestras de alimentos y agua utilizando nanosensores. Las bacterias patógenas objetivo se detectan mediante una combinación de modalidades de relajación magnética y emisión de fluorescencia.

Protocolo

1. Detección rápida de E. coli O157:H7 usando MFnS

1. Agregue varias soluciones de PBS (1X, pH 7.4, 300 μL) con cantidades crecientes del stock bacteriano ^10-6, lo que resulta en rangos de UFC de 1-100. Agregue una cantidad constante de MFnS (100 μL) a estas soluciones.
2. Cree una solución de referencia que contenga solo PBS (1X, pH 7,4, 300 μL) y MFnS (100 μL).
3. Incubar las soluciones durante 30 min a 37 °C y luego dejar que se enfríen a temperatura ambiente.
4. Transfiera soluciones individuales al relaxómetro magnético (0,47 Tesla) y registre los cambios en los tiempos de relajación (T2) en relación con las UFC en cada solución.
   1. Para registrar los cambios en los valores de T2, comience midiendo el valor de T2 de la solución de referencia que contiene solo PBS y MFnS.
      1. Coloque la solución en el relaxómetro magnético. Abra el software correspondiente, seleccione la configuración "Relajación T2" y presione "medir".
      2. Después de la recolección de la línea de base T2, mida los valores de T2 de las soluciones adicionales que se enriquecieron con varias concentraciones de bacterias.
         nota: El cambio en T2 es equivalente a la T2 basal restada de la T2 con picos.
5. Retire las muestras del relaxómetro magnético y centrifuga los tubos a 2880 x g durante 10 min.
6. Decantar el sobrenadante y resuspender los gránulos bacterianos en 100 μL de PBS (1X, pH 7,4).
7. Agregue 80 μL de cada resuspensión a una placa de 96 pocillos y registre intensidades de fluorescencia a 595 nm.
   nota: Las pruebas se pueden repetir utilizando diferentes solventes, incluyendo agua de lago, leche y otros, como se describe en la sección de resultados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro ferroso tetrahidratado	Fisher Científico	I90-500
Cloruro férrico hexahidratado	Fisher Científico	I88-500
Hidróxido de amonio	Fisher Científico	A669S-500
ácido clorhídrico	Fisher Científico	A144S-500
Ácido poliacrílico	Sigma-Aldrich	323667-100G
Edc	Thermofisher Científico	22980
Nhs	Fisher Científico	AC157270250
Anticuerpo anti-E. coli O111	Cuidado de los sueros	5310-0352
Anticuerpo anti-E. coli O157:H7 [P3C6	Abcam	AB75244
Mancha DiI	Fisher Científico	D282
Caldo de nutrientes	Difco	233000
Pellet de E. coli liofilizado O157:H7	ATCC	700728
Relaxomteter magnético	Bruker	MQ20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Lector de placas	Tecan	Infinito M200 PRO
Columna magnética	QuadroMACS	130-090-976
centrífuga	Eppendorf	Serie 5804
Centrífuga (accuSpin Micro 17)	Fisher Científico	13-100-676
Incubadora vibratoria modelo de suelo	LABORATORIO DE SHEL	SSI5
Balanza analítica	Metler Toledo	ME104E
Mezclador de vórtice digital	Fisher Científico	02-215-370
Agitador mecedora al aire libre	Fisher Científico	02-217-765