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1. Preparación de reactivos
- Medio de sales biliares: Para preparar caldo de soja tríptico (TSB) que contenga 0,4% de sales biliares (peso/volumen), resuspenda 200 mg de sales biliares en 50 mL de TSB esterilizado en autoclave. El filtro esteriliza con un filtro de 0,22 μm. Prepare medio fresco semanalmente.
Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente son una mezcla 1:1 de colato de sodio y desoxicolato de sodio aislados de vesículas biliares ovinas y bovinas. Como se demostró anteriormente, la presencia de glucosa era necesaria para la formación de biopelículas inducidas por sales biliares. TSB ha añadido glucosa en relación con el caldo Luria-Bertani (LB); y, por lo tanto, fue suficiente para inducir la formación de biopelículas en Shigella y los otros patógenos entéricos analizados. Dependiendo de las bacterias a analizar, pueden ser necesarias diferentes concentraciones de glucosa o diferentes requerimientos de azúcar.
- 0,5% p/v de cristal violeta en agua: Disuelva 2,5 g de cristal violeta en 500 ml de agua destilada. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm.
>2. Preparación de bacterias
- Cultive durante la noche los cultivos de las cepas bacterianas que se van a analizar inoculando 3 mL de TSB con una sola colonia bien aislada en un tubo de cultivo estéril. Incubar a 37 °C con agitación a 225 rpm para incubación nocturna (16 - 24 h).
nota: Las cepas deben retirarse de las existencias del congelador cada 2 a 4 semanas y mantenerse en platos de no más de 2 semanas de antigüedad.
>3. Ensayo de adherencia en fase sólida
NOTA: Este ensayo cuantifica las bacterias adherentes utilizando un método de placa de 96 pocillos. Las bacterias se cultivan estáticamente en placas de fondo plano. El lavado se realiza para eliminar las bacterias no adherentes y las bacterias adherentes se tiñen con violeta cristalino. La tinción de cristal violeta se une al peptidoglicano en la pared celular bacteriana y se puede solubilizar con etanol. El número de bacterias adherentes se determina en función de la retención de cristal violeta.
- Coloque dos tubos de 1,5 ml. Etiquete con TSB o TSB + sales biliares (BS).
- Agregue 1 mL de TSB o TSB + BS a los tubos respectivos.
- Inocular los tubos con 20 μL de cultivo durante la noche (en una dilución de 1:50).
- En una placa estéril, transparente, de fondo plano y tratada con cultivo de tejidos, se añadan 130 μL/pocillo de medio de control no inoculado a tres pocillos para que sirvan como control en blanco. Configure tres pozos de control para cada tipo de medio (TSB y TSB + BS) que se van a probar.
- Agregue 130 μL/pocillo de cultivo inoculado en tres pocillos y repita hasta que todas las condiciones experimentales se siembren por triplicado.
- Incubar durante 4 - 24 h a 37 °C de forma estática.
- Con un lector de placas, registre el OD600. Establezca los pozos de control en 'blanco'. Confirme que el medio de control esté limpio y sin evidencia de turbidez. Si se detecta alguna turbidez, deseche el experimento. Los valores de OD600 se pueden utilizar para normalizar los datos si hay diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre las cepas bacterianas.
- Retire el medio de cultivo usando una línea de vacío inclinando suavemente la placa y aspirando lentamente el medio en el borde inferior del pocillo. Asegúrese de recolectar todo el medio de cultivo sin interrumpir la población bacteriana adherente ubicada en la superficie de plástico. Si se produjo una matriz de polisacárido extracelular (EPS) durante el tiempo de incubación, la matriz se visualizará como un precipitado blanco. No altere la matriz de EPS.
- Lave suavemente los pocillos una vez con 200 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Retire el lavado PBS con la línea de vacío.
- Invierta la placa para que se seque. Deje secar un mínimo de 20 minutos.
nota: Dado que la biopelícula debe secarse completamente antes de teñir, el protocolo se puede pausar en este paso durante unas horas o incluso toda la noche. El tiempo de secado adicional no alterará el procedimiento de tinción, mientras que el secado incompleto afectará la cuantificación de los resultados y la reproducibilidad.
- Añadir 150 μL de violeta cristalino al 0,5% a cada pocillo experimental y de control.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavar los pocillos una vez con 400 μL de agua destilada. El volumen añadido ayuda a eliminar la mancha residual de cristal violeta de los lados de los pocillos. Retire el lavado con la línea de vacío.
- Lavar los pocillos cinco veces con 200 μL de agua destilada. Retire el lavado con la línea de vacío.
nota: El lavado a fondo es importante para la cuantificación. Cuando los pozos en blanco estén limpios del agua destilada y no contengan ninguna mancha violeta cristalina residual, continúe con el siguiente paso.
- Invierta la placa para que se seque, protegida de la luz. Asegúrese de que la placa se seque completamente como se indicó anteriormente.
- Detinción de los pocillos con 200 μL de etanol al 95%. Incubar la placa en la coctelera durante 30 min. Para evitar la evaporación, especialmente a temperaturas más altas, realice este paso a 4 °C.
- Con un lector de placas, registre la densidad óptica a 540 (OD540).
nota: La longitud de onda para la máxima absorbancia del cristal violeta está cerca de 590 nm. La literatura reporta un rango de OD540 a OD595 para la absorbancia de violeta cristalino; Por lo tanto, elija una longitud de onda disponible en función del lector de placas.