Un ensayo para estudiar la formación de biopelículas inducida por sales biliares a través de la detección de matrices de EPS

Resumen

Fuente: Nickerson, K. P., et al. Este video muestra un método basado en fluorescencia para cuantificar la formación de biopelículas inducida por sales biliares. Tras la adición de sales biliares en el cultivo de una bacteria entérica patógena, la producción de biopelícula se detecta utilizando una lectina fluorescente que se une a los polisacáridos en la matriz de sustancia polimérica extracelular (EPS) del biofilm.

Protocolo

1. Preparación de reactivos

1. Medio de sales biliares (BS): Para preparar caldo de soja tríptico (TSB) que contenga un 0,4% de sales biliares (peso/volumen), vuelva a suspender 200 mg de sales biliares en 50 mL de TSB esterilizado en autoclave. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm. Hacer medio fresco semanalmente.
   Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente son una mezcla 1:1 de colato de sodio y desoxicolato de sodio aislados de vesículas biliares ovinas y bovinas. Como se demostró anteriormente, la presencia de glucosa era necesaria para la formación de biopelículas inducidas por sales biliares. TSB ha añadido glucosa en relación con el caldo Luria-Bertani (LB); y, por lo tanto, fue suficiente para inducir la formación de biopelículas en Shigella y los otros patógenos entéricos analizados. Dependiendo de las bacterias a analizar, pueden ser necesarias diferentes concentraciones de glucosa o diferentes requerimientos de azúcar.
2. 0,5% p/v de cristal violeta en agua: Disuelva 2,5 g de cristal violeta en 500 ml de agua destilada. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm.
3. Concanavalina A (ConA) conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC): Reconstituir el stock en 1x PBS. Diluir el caldo concentrado de 10 mg con 400 μL de 1x PBS hasta una concentración final de 25 μg/mL, y proteger de la luz.
4. PBS + Glucosa: Disolver 0,2 g de glucosa en 10 mL 1x PBS (2% p/v de glucosa final). Esterilizar con un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco el día de su uso.
5. PBS + Sales biliares: Disolver 40 mg en 10 mL 1x PBS (0,4% p/v de sales biliares finales). Esterilizar con un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco el día de su uso.
6. PBS + glucosa y sales biliares: Disolver 40 mg de sales biliares y 0,2 g de glucosa en 10 mL 1x PBS (0,4% p/v de sales biliares y 2% p/v de glucosa final). Esterilizar con un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco el día de su uso.
7. Prepare platos de agar LB.
8. Fijación de formaldehído/glutaraldehído: Agregue 810 μL de formaldehído (37% de solución madre, 3% de concentración final) y 125 μL de glutaraldehído (25% de solución madre, 0,25% de concentración final) a 14 mL 1x PBS. Mezclar bien y conservar a 4 °C. La solución debe estar fría para un uso adecuado.
   cautela: La solución es tóxica y requiere la eliminación de desechos peligrosos.
9. Solución de montaje antidecoloración: Utilice una solución de montaje antidecoloración que contenga tinción de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para inhibir el fotoblanqueo de las muestras de microscopía inmunofluorescente mientras se tiñe fluorescente el ADN de las bacterias.

>2. Preparación de bacterias

1. Cultive durante la noche los cultivos de las cepas bacterianas que se van a analizar inoculando 3 mL de TSB con una sola colonia bien aislada en un tubo de cultivo estéril. Incubar a 37 °C con agitación a 225 rpm para incubación nocturna (16 - 24 h).
   nota: Las cepas deben retirarse de las existencias del congelador cada 2 a 4 semanas y mantenerse en platos de no más de 2 semanas de antigüedad.

3. EPS Detección de matrices

NOTA: Estos ensayos complementarios cuantifican y visualizan el EPS. En ambos, el EPS se detecta utilizando una lectina para unirse a los polisacáridos. La proteína conjugada fluorescentemente permite la cuantificación.

1. Detección semicuantitativa de EPS
   1. Coloque dos tubos de 1,5 ml. Etiquete con TSB o TSB + BS.
   2. Agregue 1 mL de TSB o TSB + BS a los tubos respectivos.
   3. Inocular los tubos con 20 μL de cultivo durante la noche (una dilución 1:50).
   4. En una placa estéril de 96 pocillos, negra, de fondo plano, tratada con cultivo de tejidos, se añadan 130 μL/pocillo de medio de control no inoculado a tres pocillos para que sirvan como control en blanco. Configure tres pozos de control para cada tipo de medio que se va a probar. Agregue 130 μL/pocillo de cultivo inoculado a los pocillos, y repita hasta que todas las condiciones experimentales estén sembradas por triplicado.
   5. Incubar durante 4 - 24 h a 37 °C de forma estática.
   6. Transfiera el medio de cultivo a una placa transparente de 96 pocillos con una pipeta, idealmente una pipeta multicanal. Tenga cuidado de recolectar todo el medio de cultivo sin interrumpir la población adherente y/o el EPS ubicado en la superficie plástica. Reservar.
   7. Fije la placa negra durante 15 min en RT usando 200 μL/pocillo de formaldehído/glutaraldehído en 1x PBS.
   8. Mientras se fija la población adherente, evalúe la fracción sobrenadante del paso 1.1.6. Con un lector de placas, registre el OD_600. Establezca los pozos de control en 'blanco'. Confirme que el medio de control esté limpio y sin evidencia de turbidez. Si se detecta alguna turbidez, deseche el experimento.
      1. Alternativamente, todo el ensayo se puede realizar en una placa inferior transparente de color negro. En esas circunstancias, se pueden registrar los valores de DO₆₀₀ y el medio de cultivo puede descartarse posteriormente antes de pasar a la etapa 3.1.7. Los valores de OD₆₀₀ se pueden utilizar para normalizar los datos en caso de que haya diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre las cepas bacterianas.
   9. Retire el arreglo y deséchelo en los desechos peligrosos.
   10. Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS usando la línea de vacío inclinando suavemente la placa y aspirando lentamente el lavado en el borde inferior del pocillo.
   11. Añadir 150 μL/pocillo de 25 μg/mL de ConA-FITC, e incubar durante 15 min en RT.
   12. Lavar suavemente dos veces con 200 μL de PBS.
   13. Agregue 150 μL de PBS a cada pocillo. Registre la fluorescencia a 488 nm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo de soja tríptico	Sigma-Aldrich	22092-500G
Concanavalin-A FITC	sigma	C7642-10mg
glucosa	sigma	G7021-1KG
Sales biliares	sigma	B8756-100G
Agar LB	sigma	L7533-1KG
Tubos de cultivo de 14 mL, 17 x 100 mm, plástico, estériles	pescador	14-959-11B
Vectashield antidecoloración rígida con DAPI	Laboratorios de vectores	H-1500
Formaldehído	Sigma-Aldrich	F1635-500
Gluteraldehído	Sigma-Aldrich	G6257
Placas de fondo plano de 96 pocillos (transparentes)	TPP	92696
Placas de fondo plano de 96 pocillos (negras)	Greiner Bio-One	655076
Placas de fondo plano de 24 pocillos (transparentes)	TPP	92424
Lector de placas de 96 pocillos	Spectramax
Lector de placas fluorescentes	Sinergia Biotek 2
Microscopio confocal o fluorescente	Microscopio confocal Nikon A1
Incubadora de agitación a 37 °C	Nuevo Brunswick Científico Excella E25
Incubadora de placas a 37 °C	Thermolyne Serie 5000