1. Preparación de reactivos
- Medio de sales biliares: Para preparar caldo de soja tríptico (TSB) que contenga 0,4% de sales biliares (peso/volumen), resuspenda 200 mg de sales biliares en 50 mL de TSB esterilizado en autoclave. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm. Hacer medio fresco semanalmente.
Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente son una mezcla 1:1 de colato de sodio y desoxicolato de sodio aislados de vesículas biliares ovinas y bovinas. Como se demostró anteriormente, la presencia de glucosa era necesaria para la formación de biopelículas inducidas por sales biliares. TSB ha añadido glucosa en relación con el caldo Luria-Bertani (LB); y, por lo tanto, fue suficiente para inducir la formación de biopelículas en Shigella y los otros patógenos entéricos analizados. Dependiendo de las bacterias a analizar, pueden ser necesarias diferentes concentraciones de glucosa o diferentes requerimientos de azúcar.
- 0,5% p/v de cristal violeta en agua: Disuelva 2,5 g de cristal violeta en 500 ml de agua destilada. El filtro esteriliza con un filtro de 0,22 μm.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS) + Glucosa: Disuelva 0,2 g de glucosa en 10 mL 1x PBS (2% p/v de glucosa final). El filtro esteriliza con un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco el día de su uso.
- PBS + Sales biliares: Disolver 40 mg en 10 mL 1x PBS (0,4% p/v de sales biliares finales). Esterilizar con un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco el día de su uso.
- PBS + glucosa y sales biliares: Disolver 40 mg de sales biliares y 0,2 g de glucosa en 10 mL 1x PBS (0,4% p/v de sales biliares y 2% p/v de glucosa final). El filtro esteriliza con un filtro de 0,22 μm. Hacer fresco el día de su uso.
- Prepare platos de agar LB.
>2. Preparación de bacterias
- Cultive durante la noche los cultivos de las cepas bacterianas que se van a analizar inoculando 3 mL de TSB con una sola colonia bien aislada en un tubo de cultivo estéril. Incubar a 37 °C con agitación a 225 rpm para incubación nocturna (16 - 24 h).
nota: Las cepas deben volver a sacarse de las existencias del congelador cada 2 a 4 semanas y mantenerse en platos de no más de 2 semanas de antigüedad.
>3. Ensayo de dispersión
NOTA: En este ensayo, se detecta el desmontaje de la biopelícula a través de la dispersión bacteriana. Aquí, se establecen biopelículas maduras y posteriormente (generalmente al día siguiente), los medios se reemplazan con PBS o PBS complementado. A continuación, se evalúa el componente sobrenadante para cuantificar el número de bacterias que se han disociado de la biopelícula.
- Coloque dos tubos de 1,5 ml. Etiquete con TSB o TSB + BS (sales biliares).
- Agregue 1 mL de TSB o TSB + BS a los tubos respectivos.
- Inocular los tubos con 20 μL de cultivo durante la noche (en una dilución de 1:50).
- En una placa estéril, transparente, de fondo plano y tratada con cultivo de tejidos, se añadan 130 μL/pocillo de medio de control no inoculado a tres pocillos para que sirvan como control en blanco. Configure tres pozos de control para cada tipo de medio que se va a probar.
- Añadir 130 μL/pocillo de cultivo inoculado a tres pocillos y repetir hasta que todas las condiciones experimentales se siembran por triplicado.
- Incubar la placa durante 4 - 24 h a 37 °C de forma estática.
- Antes de continuar, calentar el PBS, PBS + glucosa, PBS + sales biliares y PBS + sales biliares + glucosa a 37 °C. Prepare estos reactivos frescos diariamente.
- Con un lector de placas, registre la densidad óptica, OD600. Establezca los pozos de control en "blanco". Confirme que el medio esté claro y no haya evidencia de turbidez. Si se detecta alguna turbidez, deseche el experimento. Los valores de OD600 se pueden utilizar para normalizar los datos si hay diferencias significativas en la tasa de crecimiento entre las cepas bacterianas.
- Retire el medio de cultivo utilizando una línea de vacío. Asegúrese de recolectar todo el medio de cultivo sin interrumpir la población adherente ubicada en la superficie de plástico.
- Lave suavemente los pocillos dos veces con 200 μL/pocillo de PBS estéril. Retire el lavado PBS con la línea de vacío.
- Reemplace el lavado con 130 μL/pocillo de lo siguiente en tres pocillos cada uno: PBS, PBS + glucosa, PBS + sales biliares y PBS + sales biliares + glucosa. Estos reactivos deben precalentarse a 37 °C.
- Incubar la placa durante 30 min a 37 °C.
- Retire con cuidado la placa de la incubadora a 37 °C. Transfiera los sobrenadantes a una placa fresca y estéril de 96 pocillos.
- Usando una placa de 96 pocillos o un bloque de dilución, prepare diluciones seriadas de 10 veces (1:10) del sobrenadante en PBS estéril.
nota: La serie de dilución debe variar desde sin diluir hasta 10-6 dependiendo de la cepa bacteriana que se vaya a probar. Se pueden realizar experimentos piloto para determinar el rango de dilución óptimo.
- Coloque una placa de 5 μL de cada dilución en agar LB utilizando una pipeta multicanal. Incubar a 37 °C durante la noche. Cuente las colonias al día siguiente y tenga en cuenta el factor de dilución al determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) de recuperación. Para calcular el porcentaje de dispersión en relación con el control PBS 1x (establecido en 100%), divida la UFC de recuperación de cada condición de tratamiento por la UFC de recuperación de la muestra de control PBS 1x.
nota: También se pueden utilizar placas de medios de rutina para la cepa bacteriana de interés. Por ejemplo, la Shigella se puede colocar en platos de color rojo Congo. Asegúrese de que las placas estén secas para las técnicas de recubrimiento por puntos adecuadas.
