Un método para la preparación de muestras para visualizar bacterias formadoras de biopelículas en hifas fúngicas

Resumen

Fuente: Guennoc, Cora Miquel, et al, Un nuevo método para el análisis cualitativo multiescala de biopelículas bacterianas en colonias de hongos filamentosos utilizando microscopía confocal y electrónica. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe un método para cultivar y analizar cualitativamente biopelículas bacterianas en hifas fúngicas utilizando microscopía. Las biopelículas bacterianas se forman con frecuencia en las superficies fúngicas e involucran numerosos procesos de interacción bacteriano-fúngico, como la cooperación metabólica, la competencia o la depredación.

Protocolo

>1. Preparación de un biofilm in vitro de bacterias en la colonia de hongos

1. Centrifugar el cultivo bacteriano a 5.000 x g durante 3 min y suspender el pellet en 25 ml de tampón estéril de fosfato potásico 0,1 M (25 g/L KH₂PO₄ y 2,78 g/L K₂HPO₄, pH 5,8). Repita este paso una vez y ajuste la concentración bacteriana final a 10⁹ células/ml con el mismo tampón.
2. Llene una microplaca de 6 pocillos con 5 ml de la suspensión bacteriana (o tampón estéril de fosfato potásico de 0,1 M para el control negativo).
3. Corte la membrana de celofán del cultivo de hongos con una cuchilla de afeitar estéril para obtener cuadrados de celofán con una sola colonia de hongos en cada membrana. Retire con cuidado los cuadrados de celofán que contienen hifas del medio sólido con pinzas y transfiera el cuadrado de celofán que contiene hifas a un pocillo de la microplaca que contiene la suspensión bacteriana.
4. Agite suavemente la microplaca mientras las colonias de hongos aún están unidas al celofán; luego, retire las láminas de celofán, dejando las colonias de hongos en la placa.
5. Incubar la microplaca con agitación suave (~60 rpm) a una temperatura adaptada a los microorganismos estudiados.
   nota: El tiempo de incubación depende de la velocidad de establecimiento del biofilm y de la etapa a analizar. Para P. fluorescens BBc6/L. bicolor, incubar a 20 °C durante 30 min para obtener biopelículas en etapa temprana y hasta 16 horas para obtener biopelículas maduras.

>2. Microscopía confocal de escaneo láser Análisis de la formación de biopelícula

1. Preparación de la muestra
   1. Para eliminar las bacterias planctónicas y las bacterias electrostáticas adheridas a las hifas, enjuague el hongo transfiriéndolo a una nueva microplaca de 6 pocillos llena de 5 ml de una solución salina fuerte (NaCl, 17 g / L); agite suavemente durante 1 min.
   2. Transfiera el hongo a una nueva microplaca de 6 pocillos que contenga 5 ml de tampón de fosfato de potasio estéril de 0,1 M, agite suavemente durante 2 minutos y transfiera el hongo al tampón de fosfato de potasio fresco.
   3. Corte la parte de la colonia de hongos que se va a visualizar con un bisturí mientras la mantiene en el tampón de fosfato de potasio, de modo que la sección obtenida contenga aproximadamente la mitad de la colonia de hongos.
   4. Para teñir la muestra, transfiérala a una placa de Petri llena de agua estéril que contenga un colorante fluorescente adecuado (según el objetivo del análisis) e incube en la oscuridad.
      1. Para visualizar la red fúngica, utilice, por ejemplo, Congo Red (0,1% de concentración final, 5 min de incubación), lectina de aglutina de germen de trigo (WGA) conjugada con Alexa Fluor 633 (concentración final de 10 μg/ml, 10 min de incubación) o FUN1 (concentración final de 10 μM, 10 min de incubación).
      2. Si utiliza una bacteria no marcada con fluorescente, contratiña las células bacterianas con una sonda fluorescente específica de ADN entre los numerosos tintes de ADN permeados a células disponibles en el mercado. Por ejemplo, utilice DAPI (concentración final de 0,25 μg/ml, 10 min de incubación).
      3. Para visualizar las proteínas de la matriz, utilice una tinción de proteínas.
   5. Después de la tinción, enjuague la muestra transfiriéndola a una tapa de placa de Petri que contenga 10 ml de fosfato potásico estéril de 0,1 M y agite suavemente durante 1 min.
   6. Sumerja hasta la mitad un portaobjetos en la tapa de la placa de Petri y lleve delicadamente la sección cortada para que flote sobre el portaobjetos. Luego, retire lentamente el portaobjetos de la solución tampón, permitiendo que la muestra se asiente suavemente en el portaobjeto>nota: Para este paso, es muy importante proceder con cuidado para evitar la alteración de la biopelícula.
   7. Por último, añada 10 μl de medio de montaje antidecoloración a la muestra y cúbrala con un cubreobjetos de vidrio.
      nota: Una vez preparado el portaobjetos, el análisis microscópico debe realizarse lo antes posible (en un plazo máximo de 30 min) para evitar modificaciones en la estructura del biofilm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo de tejidos Falcon de 6 pocillos	Fisher Científico	08-772-33	Utilizado en 2.2 y 3.1
Rojo Congo	Fisher Científico	C580-25	Utilizado en 3.1.4.1
DIVERSIÓN Tinte de 1 celda	Thermo Fisher Scientific	F7030	Utilizado en 3.1.4.1
Aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 633 conjugado	Thermo Fisher Scientific	W21404	Utilizado en 3.1.4.1
Solución DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Utilizado en 3.1.4.2
Yoduro de propidio	Thermo Fisher Scientific	P3566	Utilizado en 3.1.4.3
Tinción de proteína FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix	Thermo Fisher Scientific	F10318	Utilizado en 3.1.4.4
Medio de montaje deslizante Fluoromount-G	Fisher Científico	OB100-01	Utilizado en 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1	Zeiss		Utilizado en 3.2.1
Software ZEN 2.1 lite negro	Zeiss		Utilizado en 3.2.1
Máquina de recubrimiento al vacío Leica EM ACE600	Leica		Utilizado en 4
GeminiSEM-FEG	Zeiss		Utilizado en 4