Análisis en tiempo real de la migración de células T residentes en diferentes regiones tumorales mediante microscopía confocal

Resumen

Fuente: Peranzoni, Elisa, et al. Imágenes ex vivo de linfocitos T CD8 residentes en cortes de tumores de pulmón humano mediante microscopía confocal. J. Vis. Exp. (2017).

Este video describe las imágenes de las células T CD8 residentes infiltrantes de tumores marcadas con anticuerpos acoplados fluorescentemente dentro de cortes de tumores de pulmón humanos. Esta técnica permite analizar en tiempo real la migración de linfocitos T CD8 mediante microscopía confocal.

Protocolo

>1. Inmunotinción de células T CD8 residentes y células tumorales

1. Diluir los anticuerpos (concentración final 10 μg/mL) y el colorante nuclear (concentración final 1 μg/mL) en medio RPMI-1640 sin rojo fenol.
   nota: Utilice anticuerpos anti-CD8 (IgG murina, clon SK1) y anti-EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales) (IgG murina HEA-125) acoplados fluorescentemente para marcar los linfocitos T CD8 y las células epiteliales tumorales, respectivamente. Utilice el anticuerpo anti-CD90/Thy1 acoplado con fluorescencia (IgG murina, clon 5E10) para marcar fibroblastos y células endoteliales activadas. Utilice 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para marcar el núcleo de las células con una membrana plasmática comprometida con el fin de evaluar la viabilidad del tejido.
2. Retire las placas de cultivo de la incubadora y utilice una pipeta para aspirar cualquier líquido dentro de las arandelas de acero inoxidable. No retire el medio RPMI-1640 de 1,1 ml colocado debajo de los insertos de cultivo celular.
3. Sin tocar el corte y con la punta de una pipeta, agregue 40 μL de la solución que contiene los anticuerpos en cada corte tumoral.
4. Incubar la placa a 37 °C durante 15 min para permitir la tinción de anticuerpos.
5. Con pinzas finas, retire las arandelas, saque las rodajas y sumérjalas 10 s en medios RPMI-1640 sin rojo fenol. Vuelva a colocar las rodajas en los insertos de cultivo celular y agregue una gota de medio RPMI-1640 sin rojo de fenol en cada rodaja individual. Mantenga la placa a 37 °C durante 10 min. Proceda a la toma de imágenes.

2. Obtención de imágenes y análisis de la migración de células T CD8 residentes dentro de cortes de tumores de pulmón humanos

NOTA: El microscopio confocal utilizado en este protocolo es un disco giratorio vertical equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25x (25x/0.95 N.A.).

1. Preparación de la configuración del microscopio
   1. Ajuste la temperatura de la cámara de calor del microscopio a 37 °C unas horas antes de comenzar la sesión de imagen.
   2. Establezca un sistema para perfundir constantemente cortes tumorales con medio RPMI oxigenado (5% CO₂, 95% O₂) libre de rojo de fenol (Figura 1). Utilice una bomba peristáltica para hacer fluir el medio de perfusión hacia la cámara de imágenes y aspirar la solución a un matraz de recogida de residuos.
   3. Haga funcionar la bomba peristáltica para permitir que la solución oxigenada pase a través de los tubos de perfusión.
2. Con pinzas finas, saque la rebanada de la placa de 6 pocillos y transfiérala a la placa de plástico de 35 mm llena de medio RPMI sin rojo fenol. Inmovilice la loncha con un anclaje de rodaja de 19,7 mm de diámetro con roscas espaciadas de 2 mm. Coloque la placa de Petri en la platina de imágenes del microscopio. Conecte las puntas de entrada y salida del sistema de perfusión. Encienda el sistema de perfusión y ajuste el caudal del medio a 0,8 mL/min.
3. Baje el objetivo de inmersión en agua a la rebanada. Enfócate en la parte superior de la rebanada con luz de campo brillante. Usando la luz fluorescente adecuada, seleccione una región de interés que contenga células T CD8, islotes tumorales (positivos para EpCAM) y un área de estroma (positivos para CD90). Verifique la viabilidad de las células dentro del corte evaluando la tinción de DAPI en la superficie de corte y más profundamente en el tejido.
   NOTA: Un corte sano contiene solo una minoría de células DAPI positivas a varias micras de la superficie de corte.
4. Establezca una sesión de imágenes con las siguientes acciones.
   1. Dependiendo de la intensidad de la señal fluorescente de los 3 fluoróforos, ajuste el tiempo de exposición entre 50 y 800 ms y la intensidad del láser entre 20 y 40%.
   2. Seleccione el grosor de la pila z para obtener una imagen dentro del corte del tumor.
      nota: Aquí, se capturaron entre 10 y 12 planos ópticos que abarcan una profundidad total de 60 a 70 μm en la dimensión z.
   3. Seleccione la posición inicial aproximadamente a 10 μm por debajo de las primeras células T CD8 marcadas.
   4. Defina el intervalo de tiempo entre cada imagen de pila z entre 10 y 30 s y el tiempo total de grabación entre 10 y 30 min.

Resultados

Figura 1: Fotografías del sistema de perfusión. A) La solución RPMI sin rojo fenol está enriquecida en 5% CO₂, 95%_O2. B) A continuación, la solución se perfunde mediante una bomba peristáltica. C) La solución RPMI ingresa a la placa de cultivo a través de la entrada. A la salida, la solución es aspirada por la bomba desde la cámara hasta un contenedor de residuos. Tenga en cuent...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio confocal vertical	Leica	Se recomienda el uso de un disco giratorio confocal
Software Imaris	Plano de bits		Este software se utiliza para la visualización de imágenes y el seguimiento de la migración de células T
Pinzas finas	Instrumentos de precisión mundial	14142
Insertos de cultivo de 30 mm	Millipore	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio, Suplemento GlutaMAX	ThermoFisher	61870010	El medio RPMI completo se realiza mediante la adición de un 10 % de suero de ternero fetal inactivado por calor y penicilina/estreptomicina
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher	20012019
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Invitrogen	14170088
Agarosa a baja temperatura de gelificación, tipo VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Pegamento de cianoacrilato de butilo no tóxico, Vetbond	3M	Año 1469
Anclajes de corte, diámetro de 19,7, roscas con separación de 2 mm	Instrumentos Warner	64-1415
Arandelas de acero inoxidable, 5 mm de diámetro interior	amazona	B004K1FDGQ
BV605-anti-CD8 conjugado (clon SK1)	BD Biociencias	565289
Anti-EpCAM conjugado por FITC (clon HEA-125)	Miltenyi Biotec	130-098-113
BV510-conjugado anti-CD90 (clon 5E10)	Bioleyenda	328125
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI	ThermoFisher	D1306