NOTA: Este protocolo enfatiza el uso de la citometría de flujo FRET para detectar la actividad de siembra a partir de muestras biológicas de ratón. También es compatible con fibrillas recombinantes y muestras biológicas humanas. La eutanasia y la extracción de cerebro en ratones se realizaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por la IACUC.
1. Extracción de cerebro
- Después de la anestesia profunda con isoflurano (2%), perfundir un ratón con PBS helado que contenía heparina al 0,03% y extraer el cerebro siguiendo los detalles descritos en Gage et al.
- Coloque el tejido extraído en un vial criogénico y congele rápidamente colocándolo en nitrógeno líquido. Alternativamente, congele el pañuelo en hielo seco. Una vez congelado, transfiera el tejido a -80 °C y almacene durante un período prolongado de tiempo, si es necesario><.
nota: Este protocolo es compatible con homogeneizados cerebrales enteros o regiones cerebrales microdisecadas. Véase Hagihara et al.para un protocolo detallado de microdisección.
>2. Preparación de material de semilla biológico
- Prepare el tampón de homogeneización disolviendo los inhibidores de la proteasa (sin ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)) en 1x TBS (solución salina tamponada con Tris, 1 comprimido por 10 ml). Agite vigorosamente y almacene en hielo. Los inhibidores de la proteasa deben estar libres de EDTA para preservar la viabilidad de las células biosensoras.
- Pese el tejido cerebral congelado en un bote de pesaje desechable y transfiéralo a un tubo cónico de 5 ml. Agregue un tampón de homogeneización helado de modo que la solución final tenga un 10% de peso/volumen. Almacene temporalmente en hielo. La masa de tejido y el volumen del tampón de homogeneización posterior variarán según el tamaño del cerebro y/o las regiones utilizadas. Aquí, un hemicerebro de ratón adulto que pesa 0,2 g se suspende en 2 ml para una solución del 10% p/vol.
- Transfiera las muestras a una cámara frigorífica y ajuste un sonicador de sonda a la configuración adecuada. Para la sonicación de la sonda con un Omni Ruptor (que se muestra aquí), ajuste la potencia al 20%, lo que corresponde a aproximadamente 75 W. Utilice un modo de pulso para asegurarse de que las muestras no se sobrecalientan durante la sonicación. Ajuste el pulsador al 30%, lo que corresponde a aproximadamente 500 ms.
- Limpie la punta del sonicador de la sonda enjuagando con agua, isopropanol y agua de nuevo, limpiando la sonda entre cada solución. Asegúrese de enjuagar y limpiar tanto los lados como la parte inferior de la sonda con toallitas de laboratorio.
- Trabajando con una muestra a la vez, sumerja la punta de la sonda en el tampón de homogeneización y ponga en marcha el sonicador. Usando los ajustes de potencia y pulso descritos anteriormente, entregue 25 pulsos en total. Asegúrese de que el tejido esté completamente en suspensión. Tenga cuidado de evitar la formación de espuma en la muestra durante este paso.
nota: Las muestras son susceptibles a la formación de espuma si a) el volumen total es bajo o b) el homogeneizado se calienta. Con este instrumento específico, no sonique con volúmenes inferiores a 250 μl. Para garantizar que las muestras permanezcan frías, los tubos pueden almacenarse en hielo durante este paso.
- Limpie la sonda limpiando el lisado residual, luego administre 10 pulsos en un vaso de precipitados con agua limpia. Enjuague los lados y la parte inferior de la sonda con agua, isopropanol y agua nuevamente (como en el paso 2.4), secando entre cada paso. Para evitar la contaminación, enjuague bien la sonda entre muestras.
nota: Con los agregados de tau, no hemos encontrado que sean necesarios métodos de limpieza más estrictos para prevenir la contaminación de muestra a muestra. Otros amiloides, sin embargo, pueden requerir cuidados adicionales que han sido ampliamente descritos en la literatura.
- Almacene los homogeneizados en hielo hasta que se hayan procesado todas las muestras.
- El centrifugado se homogeneiza a 21.300 x g durante 15 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Deseche la bolita. Alicuente el sobrenadante y almacene los lisados a -80 °C para su uso posterior. Sin embargo, evite los ciclos de congelación/descongelación de los homogeneizados, ya que esto reduce la eficiencia de la siembra.
>3. Replaca de células biosensoras
NOTA: Utilice cuatro líneas celulares para este ensayo: HEK 293T (línea celular #1), RD-P301S-CFP (línea celular #2), RD-P301S-YFP (línea celular #3) y RD-P301S-CFP/YFP (línea celular #4). Consulte la Tabla 1 de referencia para conocer la contribución de cada línea celular al ensayo.
- En un ambiente estéril, aspire el medio de cultivo. Enjuague las células con solución salina tibia tamponada con fosfato (PBS) y aspire. Tripsinar las células (3 ml de tripsina-EDTA (0,05%)) durante 3 min, enfriar con un medio de cultivo tibio (9 ml de DMEM, 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de GlutaMax) y transferir inmediatamente las células a un tubo cónico.
- Centrifugar las células a 1.000 x g durante 5 min a RT. Aspirar el medio y resuspender el pellet de la célula en un medio de cultivo tibio.
- Con un hemocitómetro, determine la densidad celular para cada línea celular. La densidad celular variará dependiendo de la confluencia en el momento de la cosecha y el volumen de resuspensión. Vuelva a suspender las células extraídas de una placa de 10 cm con una confluencia del 90% en un medio de 10 ml, para que la densidad celular sea de aproximadamente 1 millón de células/ml.
- Haga una mezcla maestra de células + medios de modo que cada pocillo de una placa de 96 pocillos contenga 35.000 células en un medio de 130 μl (por ejemplo, para hacer una mezcla maestra para 100 pocillos, resuspenda 3,5 millones de células en un medio de 13 ml). Modifique el número de celda para que se ajuste a los diseños experimentales individuales y a las líneas de tiempo. Para el tratamiento celular ~ 18 horas después de la siembra, agregue 35,000 celdas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Usando una pipeta multicanal, pipetee lentamente 130 μl de suspensión celular de mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos de fondo plano. Durante el recubrimiento, coloque la punta de la pipeta en el centro del pocillo, sin tocar el fondo de la placa.
nota: Aunque el formato de recubrimiento se puede modificar, se recomienda hacer n = 4 pocillos para cada una de las líneas celulares de 1 a 3 por placa. El resto de la placa (n = 84) está reservado para la línea celular #4 (células biosensoras).
- Deje que las células se asienten dejando la placa sin tocar durante 10 minutos en RT. Incubar O/N a 37 °C, 5% de CO2 y ≥80% de humedad relativa.
>4. Tratamiento de células
>NOTA: Al día siguiente, cuando las células biosensoras tau tengan un 60-65% de confluentes, prepare los complejos de transducción de semillas de la siguiente manera:
- En un tubo, combine el reactivo de transfección, como Lipofectamine, con medios de suero reducido, como Opti-MEM, para hacer una mezcla maestra. Por pocillo, agregue 1,25 μl de reactivo de transfección y 8,75 μl de medio sérico reducido. Agite el tubo suavemente para mezclar, gire brevemente e incube durante 5 minutos a RT.
- En otro tubo, combine el material de semilla (alícuota de lisado del paso 2.9) con medios de suero reducido.
nota: El volumen del material de semilla variará según el experimento individual. Al elegir el volumen de semillas, tenga en cuenta: la abundancia de semillas en una muestra y la toxicidad potencial. Los homogeneizados crudos pueden ser tóxicos para las células. Como tal, use el volumen más bajo posible para monitorear el efecto deseado. Los volúmenes de lisado/pocillo previamente analizados oscilan entre 1 y 5 μl, lo que corresponde a 5 a 20 μg de proteína total. Asegúrese de que el volumen total por pocillo (semillas + medios de suero reducido) sea de 10 μl.
- Combine el contenido de los dos tubos descritos en 4.1 y 4.2, agite suavemente para mezclar, centrifugue brevemente (1.000 x g, 5 segundos) e incube a RT durante al menos 20 minutos y hasta 2 horas.
- Pipetear suavemente 20 μl de complejo de transducción en el lateral de los pocillos de biosensores individuales. Utilice tres réplicas técnicas, si es posible. Regrese las células tratadas a la incubadora durante 24-48 horas. Incubar en las mismas condiciones que se describen en el paso 3.6.
nota: La condición de control negativo apropiada para esta configuración son las células biosensoras tratadas con liposomas vacíos (es decir, reactivo de liposomas + medios de suero reducido) porque la aplicación de fosfolípidos introduce un ligero cambio en el perfil de fluorescencia en relación con las células biosensoras no expuestas al reactivo de liposomas.
>5. Recolección de células para citometría de flujo FRET
NOTA: Antes de recolectar células, generalmente 24-48 horas después del tratamiento, es posible obtener una lectura preliminar de la actividad de siembra utilizando el filtro de proteína fluorescente verde (GFP) en un microscopio de fluorescencia invertida estándar. Las células tratadas sin material semilla (es decir, liposomas vacíos) mostrarán fluorescencia difusa, mientras que las células tratadas con material semilla mostrarán inclusiones intracelulares intensas punteadas y reticulares (Figura 1A-B).
- Con una pipeta multicanal, aspire todo el medio celular (150 μl). Tripsinar las células (50 μl) durante 5 minutos y enfriar con 150 μl de medio de cultivo refrigerado. No incluya un enjuague de PBS antes de la tripsinización en este paso, ya que puede causar elevación celular y posterior pérdida celular. Excluya cualquier célula muerta y residuos contaminantes durante la citometría de flujo mediante estrategias de compuerta.
- Inmediatamente después del enfriamiento, transfiera las celdas a una placa inferior redonda de 96 pocillos y centrifugue a 1.000 x g durante 5 minutos en RT.
- Aspire y deseche el medio, teniendo cuidado de no perturbar la pelletización de la celda.
- Suavemente, pero a fondo, vuelva a suspender el pellet de la célula en 50 μl de paraformaldehído al 2% e incube durante 10 min. Alternativamente, ejecute las células vivas, aunque la fijación proporciona resultados más limpios y consistentes.
- Centrifugar las células a 1.000 x g durante 5 min en RT. Aspirar y desechar el paraformaldehído, teniendo cuidado de no alterar la pellet de la célula.
- Con cuidado, pero a fondo, vuelva a suspender el pellet de celda en un tampón de citometría de flujo refrigerado de 200 μl (solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), 1% de FBS, 1 mM de EDTA) y pase la placa lo antes posible para evitar la aglomeración de células.
>6. Citometría de flujo FRET
NOTA: Utilice un citómetro de flujo como el MACSQuant VYB, que está equipado con líneas láser y juegos de filtros compatibles con FRET (Tabla 2). Para cada paso dentro de esta sección, haga clic en el pozo de interés utilizando la plantilla de 96 pocillos del software y haga clic en "reproducir" para comenzar la captación y el flujo de la muestra. Realice gráficos o tablas estadísticas haciendo clic en el icono 'nueva ventana de análisis'. Cambie los parámetros del eje en gráficos bivariados individuales haciendo clic en el título en el eje X o Y y seleccionando el filtro adecuado. Para cambiar las poblaciones de células o las señales de fluorescencia, aumente o disminuya los voltajes asociados con los filtros apropiados. Con este instrumento, ejecute <1.000 eventos/segundo para garantizar un monitoreo preciso de una sola celda.
- Haga un gráfico bivariado de área de dispersión lateral (SSC-A) vs área de dispersión directa (FSC-A) y, con la línea de celda # 1 en ejecución, ajuste los voltajes de SSC y FSC hasta que la población de celdas esté en el cuadrante inferior izquierdo. Haga clic en la herramienta polígono y defina la población de celdas (Puerta P1). Para ver todos los parámetros de compuerta, consulte la Figura 2.
- Cree un gráfico bivariante FSC-H (altura) frente a FSC-A, y aplique la Puerta P1 a este gráfico haciendo clic en "en vivo" encima del gráfico y seleccionando P1. Con la línea de celda #1 en ejecución, haga clic en la herramienta polígono y defina celdas individuales (Puerta P2).
- Realice 3 gráficos de histograma, uno para cada uno de los filtros de interés: CFP, YFP y FRET. Aplique la Puerta P2 a todas estas parcelas haciendo clic en "en vivo" encima de las parcelas y seleccionando P2. Con la línea de celda #1 en ejecución, ajuste los voltajes de modo que la población media de celdas en los histogramas CFP, YFP y FRET esté entre 0 y 1. Para medir CFP y FRET, excite las células con el láser de 405 nm y capture la fluorescencia con un filtro de 450/50 nm y 525/50 nm, respectivamente. Para medir YFP, excite las células con un láser de 488 nm y capture la fluorescencia con un filtro de 525/50 nm. Los ajustes del láser y del filtro se describen con más detalle en la Tabla 2.
- Realice la compensación por el desbordamiento de CFP en los canales FRET e YFP.
nota: La compensación es el proceso de corrección del desbordamiento de la fluorescencia. El desbordamiento de fluorescencia ocurre cuando se detecta la emisión de fluorescencia de un fluorocromo dentro de un filtro diseñado para medir la señal de otro fluorocromo. Con la compensación adecuada, la fluorescencia de derrame de CFP se puede eliminar de los canales FRET e YFP.
nota: La compensación requiere la presencia de células positivas y negativas de fluorescencia. Por lo tanto, para compensar las células positivas para CFP (línea celular # 2), se deben agregar células negativas (línea celular # 1) a la muestra antes de la ejecución.
- Pico en 30 μl de suspensión de la línea celular #1 de un solo pocillo en 200 μl de suspensión de la línea celular #2 inmediatamente antes de la compensación.
- Haga clic en el icono "Configuración del instrumento", luego en la pestaña "compensación" y marque "matriz" para abrir la tabla de compensación.
- Elabore una gráfica bivariante FRET-A frente a CFP-A y aplique la puerta P2, como se describe en el paso 6.3. Con las líneas celulares 1+2 en ejecución, haga clic en el icono de 'cuadrante' y dibuje cuadrantes de manera que las poblaciones de fluorescencia negativa y -positiva estén separadas por los dos cuadrantes inferiores (Gates LL3 y LR3, respectivamente).
- Cree una tabla de estadísticas que muestre la intensidad de fluorescencia media (MFI) de FRET para las puertas LL3 y LR3. Ajuste el parámetro FRET en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal FRET sea equivalente entre LL3 y LR3. Después de este paso, el MFI de la señal FRET es igual entre las células no teñidas y las células CFP positivas, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de CFP en el canal FRET.
- Realice una gráfica bivariante YFP-A frente a CFP-A y aplique la puerta P2, como se describe en el paso 6.3. Dibuje cuadrantes (LL4 y LR4) similares a los realizados en el paso 6.4.3.
- Cree una tabla de estadísticas que muestre la MFI de YFP para LL4 y LR4. Ajuste el parámetro YFP en la matriz de compensación hasta que el MFI de la señal YFP sea equivalente entre LL4 y LR4. Siguiendo este paso, el MFI de una señal YFP es igual entre las células no teñidas y las células CFP positivas, lo que sugiere la ausencia de desbordamiento de CFP en el canal YFP.
- Después de la configuración de la puerta y la compensación, resalte los pozos de interés y ejecute el resto de la placa.
- Una vez que se hayan ejecutado todas las muestras, exporte los archivos de datos haciendo clic en 'archivo' y luego en 'copiar'. Seleccione la pestaña 'archivos de datos', resalte la carpeta del experimento y haga clic en 'copiar'.
