Una técnica para evaluar el efecto inhibidor de la exposición a toxinas en las corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura (mEPSC)

Resumen

Fuente: Hubbard, K. et. al., Evaluación funcional de neurotoxinas biológicas en cultivos en red de neuronas del sistema nervioso central derivadas de células madre.J. Vis. Exp. (2015)

El video muestra el análisis electrofisiológico de neuronas derivadas de células madre embrionarias después de la exposición a neurotoxinas. El tratamiento de estas neuronas con neurotoxinas botulínicas reduce la frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas en miniatura, lo que confirma la inhibición de la transmisión sináptica.

Protocolo

>1. Adaptación de células madre embrionarias (ESC) al cultivo en suspensión libre de células alimentadoras

1. Descongele las ESC a 37 °C hasta que quede una astilla de hielo.
2. Con una pipeta P1000, transfiera suavemente 1 - 2,5 x 10⁶ ESC disociadas a una placa no tratada con cultivo de tejidos que contenga 10 ml de medio ESC precalentado. Incubar en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada durante 20 horas a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO₂).
3. Después de 20 horas, lavar las células transfiriendo suavemente el cultivo en suspensión a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta serológica de 10 ml. Pellet ESCs durante 3 min a 200 x g. Durante el centrifugado, agregue 10 ml de plato ESC fresco de adherencia media a baja.
4. Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de evitar que el pellet de la celda se desprenda, y agregue 1 ml de medio ESC fresco al pellet de la celda. Transfiera las células a la placa bacteriana con una pipeta P1000 y devuélvalas a la incubadora.
5. Observe las células diariamente hasta que los agregados se vuelvan visibles a simple vista (generalmente de 4 a 8 días (d); los agregados serán de 0,2 a 0,5 mm). Si los agregados no son evidentes después de 4 días, repita el paso 1.3. Una vez que los agregados sean visibles, disocie y mantenga las ESC como se describe en la Sección 2.

>2. Aprobación y mantenimiento de ESC

1. Transfiera los agregados ESC a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta estéril de 10 ml y deje que los agregados se depositen en una peleta compacta (generalmente de 3 a 5 minutos). Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la pelletización celular, y lavar los agregados con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Aunque se recomienda la sedimentación por gravedad, alternativamente, las celdas de pellets a 100 x g durante 2,5 minutos para ahorrar tiempo.
2. Aspirar PBS y añadir 500 μl de tripsina. Incubar los agregados en tripsina durante 3 min en un baño de agua a 37 °C. Añadir 500 μl de medio ESC para diluir la tripsina y triturar suavemente 10 veces con una pipeta P1000 para romper los agregados. Cuente las células con un hemocitómetro.
3. Granular las células disociadas durante 3 min a 200 x g y resuspender las células hasta una concentración final de 1,0 x 10⁷ células/ml en medio ESC. Transfiera 150 μl (1,5 x 10⁶ células) a 10 ml de medio ESC fresco en una placa bacteriana de 10 cm y devuélvalo a la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas. El exceso de ESC puede diferenciarse, criopreservarse a 1 - 5 x 10⁶ células/ml en medio ESC al 90% suplementado con dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% o desecharse.
4. Paso de agregados cada 48 hr. Los agregados listos para el paso serán claramente visibles, con diámetros superiores a 0,5 mm.
   nota: La descongelación y el cultivo de células criopreservadas y adaptadas a la suspensión se realizan según los pasos 1.2 a 1.4. Los agregados estarán listos para el paso dentro de las 48 a 72 horas.

>3. Diferenciación neuronal

NOTA: Realice los pasos 3.1 - 3.5 antes del mediodía y el paso 3.7 después del mediodía. En la Figura 1A se presenta una descripción general de los procedimientos de diferenciación.

1. Disocie las ESC como en los pasos 2.1 a 2.5. Transfiera 350 μl (3,5 x 10⁶) de ESC disociadas a una placa de baja fijación de 10 cm que contenga 25 ml de medio de diferenciación. Colóquelo en un agitador orbital ajustado a 30 - 45 rpm dentro de una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C con 5% de CO₂. Este es el primer día de diferenciación, denominado día in vitro (DIV) -8,
   nota: El uso de una placa de fijación ultra baja aumenta el costo del método, pero produce rendimientos ligeramente mayores que las placas de Petri bacterianas, ya que los agregados ocasionalmente pueden adherirse a las placas de Petri. Los volúmenes medianos y los números de celdas se pueden escalar en consecuencia si se prefieren diferentes tamaños de platos.
2. Después de 48 horas (DIV -6), utilice una pipeta de 25 ml para transferir los agregados celulares diferenciadores a un tubo cónico de 50 ml. Agregue inmediatamente 25 ml de medio de diferenciación fresco a la placa de Petri.
3. Deje que los agregados se asienten durante 2 a 5 minutos, produciendo un pellet visible de 1 a 2 mm de profundidad. Ignore las células individuales o los agregados pequeños que permanecen en suspensión. Aspire con cuidado el medio y transfiera el pellet de celda de vuelta a la placa de Petri con un P1000. Coloque en un agitador giratorio en una incubadora de cultivo de tejidos.
4. En DIV -4, repita el paso 3.2. El pellet tendrá entre 2 y 4 mm de profundidad. Sustituya 30 ml de medio de diferenciación suplementado con 6 μM de ácido retinoico (AR) totalmente trans por la placa de Petri. Regrese al agitador giratorio en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas adicionales.
5. En DIV -2, repita el paso 3.3. El pellet tendrá entre 4 y 8 mm de profundidad en este punto.
6. En DIV -1, prepare las superficies de recubrimiento como en la Sección 4.
7. En DIV 0, descongele 5 ml de medio de tripsinización de células progenitoras neurales (NPC) prealícuotas y congeladas a 37 °C durante 5 a 10 min y colóquelo en una campana de cultivo de tejidos. Con una pipeta de 25 ml, transfiera los agregados diferenciadores a un tubo cónico de 50 ml. Deje que los agregados se asienten y aspire cuidadosamente el medio. Lave el pellet dos veces con 10 ml de PBS, permitiendo que los agregados se asienten entre lavados.
8. Después del segundo lavado con PBS, añadir 5 ml de medio de tripsinización NPC al pellet e incubar a 37 °C durante 5 min. Agitar suavemente el tubo después de 2,5 min.
9. Añadir 5 ml de inhibidor de tripsina (ITS) de soja al 0,1% para inactivar la tripsina y mezclar invirtiendo. Triturar suavemente de 10 a 15 veces con una pipeta serológica de 10 ml hasta obtener una suspensión celular relativamente homogénea.
10. Transfiera lentamente la suspensión celular a un filtro celular de 40 μm o 70 μm colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Una vez filtrada toda la suspensión, añadir 1 ml de medio N2 para lavar las células restantes a través del filtro y pellet la suspensión celular disociada durante 6 min a 200 x g.
11. Aspire el medio sin alterar el pellet. Lavar las celdas dos veces con 10 ml de medio N2, pellets durante 5 min a 200 x g y triturar entre lavados con un P1000. Antes del segundo lavado, cuente las células con un hemocitómetro.
12. Resuspender las células en medio N2 a 1 x 10⁷ células por ml y placas de neuronas derivadas de células madre embrionarias (ESN) a una densidad celular de 150.000 a 200.000 células/^cm2.
13. Transfiera las ESN recién plateadas a una incubadora de cultivo de tejidos humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ y manténgalas como en la sección 5.

>4. Preparación de superficies de cultivo para el recubrimiento de precursores neuronales en DIV 0

1. Prepare los platos tratados con cultivo de tejidos al menos 1 día antes de emplatar. Añadir suficiente polietileneimina (PEI; 25 μg/ml en H₂O estéril) o poli-D-lisina (PDL; 100 μg/ml en H₂O estéril) para cubrir las placas de plástico tratadas con cultivo de tejidos e incubar O/N a 37 °C.
2. La mañana del emplatado, lave los platos dos veces con H₂O de doble destilación y una vez con PBS. Después del lavado final, agregue suficiente medio N2 para cubrir el plato (por ejemplo, 1 ml por pocillo de un plato de 12 pocillos o 4 ml por plato de 6 cm).
3. Prepare cubreobjetos de vidrio de 18 mm al menos un día antes del recubrimiento de las neuronas. Limpie los cubreobjetos mediante limpieza con plasma durante 4 min.
4. Transfiera inmediatamente los cubreobjetos limpios a un parafilm lavado con etanol en el fondo de un plato estéril grande y agregue 400 μl de solución de PEI o PDL, preparada como en el paso 4.1. Incubar durante la noche (O/N) a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos.
5. Por la mañana, lavar las cubreobjetos tres veces con agua y añadir 5 μg/ml de laminina en PBS durante 1 a 3 horas a 37 °C. Antes de disociar las neuronas, aspire la laminina e inmediatamente transfiera el cubreobjetos a un pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga 1 ml de medio NPC, asegurándose de mantener el lado tratado hacia arriba.
6. Guarde los platos y cubreobjetos a 37 °C hasta que los NPC estén listos para emplatar.

>5. Mantenimiento de las neuronas

1. En DIV 1, aspire el medio y reemplácelo con el medio de cultivo N2.
2. En DIV 2 y 4, aspire el medio y reemplácelo con el medio de cultivo B27.
3. En DIV 8, aspire el medio y reemplácelo con un medio de cultivo B27 que contenga inhibidores mitóticos para eliminar las células no neuronales contaminantes.
4. En DIV 12, sustitúyase por el medio de cultivo B27.
5. No retire los ESN DIV 12⁺ del 5% de CO₂ hasta que esté listo.

>6. Ensayo de inhibición medida de la transmisión sináptica (MIST) para cuantificar corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura

>PRECAUCIÓN: Las neurotoxinas clostridiales son las sustancias más venenosas conocidas, con valores estimados de LD₅₀ en humanos tan bajos como 0,1 - 1 ng/kg. Obtenga las aprobaciones necesarias antes de usar estas toxinas y tome las precauciones adecuadas.

1. Diluir cuidadosamente la NTBo/A a 100x, la concentración final deseada en el medio de cultivo de ESN, y calentar a 37 ºC. Añadir el volumen adecuado de toxina a los cultivos de ESN DIV 21+, agitar la placa de cultivo y volver a la incubadora.
2. Si las células se van a analizar más de 4 horas después de la intoxicación, agregue una toxina a la placa y revuelva sin eliminar el 5% de CO₂, como directamente en la incubadora o en una cámara de CO₂ constante.
3. En el momento adecuado, aspire el medio de cultivo de ESN y lave dos veces con tampón de registro extracelular (ERB). Añadir 4 ml de ERB suplementado con 5,0 μM de tetrodotoxina y 10 μM de bicuculina, bloqueando los potenciales de acción y antagonizando la actividad del receptor GABA_A, respectivamente.
4. Transfiera el plato al equipo de electrofisiología. No se requiere perfusión ni control de temperatura para el ensayo MIST.
5. Tire del vidrio de borosilicato con un extractor de micropipetas para producir una pipeta de registro con 5-10 mΩ de resistencia y llénela con tampón de registro intracelular. Sumerja suavemente la pipeta de grabación llena en el reactivo siliconizante antes de grabar.
6. Con una jeringa llena de aire, proporcione presión positiva a medida que la pipeta de registro se baja en el ERB. Después de aterrizar suavemente la pipeta de registro en el soma de la neurona que se va a registrar, retire la presión positiva y forme un gigaseal. Disminuya el voltaje de retención a -70 mV. Aplique con cuidado la presión negativa para romper en la configuración de celda completa.
7. Cambie a la pinza amperimétrica para monitorear y registrar el potencial de membrana en reposo. Sin ajuste por los potenciales de unión líquida, el potencial de membrana en reposo estará entre -67 y -82 mV.
8. Realice un registro continuo de pinza de voltaje de -70 mV durante 4 a 5 minutos para detectar corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura (mEPSC).
9. Analice 4 minutos de los datos registrados para la detección de mEPSC utilizando el software de detección de picos con los siguientes ajustes: Umbral, 5; Período para buscar un máximo local, 10.000 μseg; Tiempo antes de un pico para la línea de base, 5.000 μseg; Período para buscar un tiempo de desintegración, 20.000 μseg; Fracción del pico para encontrar un tiempo de decaimiento, 0,37; Período para promediar una línea de base, 1.000 μseg; umbral de área, 20; Número de puntos hasta el pico promedio, 1; Dirección del pico, negativa.
10. Recopile y guarde información sobre los eventos detectados. Divida el número de eventos detectados en 4 minutos por 240 para determinar la frecuencia mEPSC en Hz.
11. Recoja las frecuencias de mEPSC para 8 a 12 controles y de 8 a 12 muestras tratadas con BoNT para cada condición de exposición. Analice la frecuencia en comparación con los controles emparejados por edad y lote. Determinar la significación estadística del porcentaje de inhibición de la actividad sináptica utilizando ANOVA de un factor y la prueba post-hoc de Dunnett.

Resultados

Figura 1. Las ESN adaptadas a la suspensión permanecen mitóticamente estables y expresan marcadores de pluripotencia.(A) Esquema de mantenimiento y diferenciación de ESC. La presencia o ausencia de ácido retinoico (AR) o factor inhibidor de la leucemia (LIF) se marca con un + o –. Se proporciona una comparación entre los días in vitro (DIV) y las etapas clásicas de desarroll...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tabla 1. ESC y ESN
DMEM de eliminación	Tecnologías de la Vida	10829-018	Medios de comunicación: Medio de cultivo ESC
			Formulación y notas: 500 mL
100x MEM NEAA	Tecnologías de la Vida	11140-050	Medios: almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes
			Formulación y notas: 6 mL
200 mM de L-Alanil-L-Glutamina	ATCC	30-2115	6 mL
FBS calificado por ES	Célula madre aplicada	ASM-5007	90 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	3 mL
55 mM 2-mercaptoetanol	Tecnologías de la Vida	21985-023	1.1 mL
107 Unidades/mL LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
DMEM de eliminación	Tecnologías de la Vida	10829-018	Medio: Medio de diferenciación ESC
			Formulación y notas: 436.6 mL
100x MEM NEAA	Tecnologías de la Vida	11140-050	Medios: almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes
			Formulación y notas: 5 mL
200 mM de L-Alanil-L-Glutamina	ATCC	30-2115	5 mL
Suero con certificación ESC	Célula madre aplicada	ASM-5007	50 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
55 mM 2-mercaptoetanol	Tecnologías de la Vida	21985-023	0,9 ml
PBS de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Medio: Medio de tripsinización de NPC
			Formulación y notas: 100 mL
0,5 M EDTA (18,3%)	Sigma-Aldrich	3690	Medio: congelación en alícuota de 5 mL
			Formulación y notas: 0,266 mL
tripsina	Sigma-Aldrich	T8802	50 mg
Polietileneimina (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Medios: Soluciones de recubrimiento de superficies
			Formulación y notas: 2,5 μg/mL en H20
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich	P7280	Medios: usar dentro de 1 semana
			Formulación y notas: 100 μg/mL en H20
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/mL en H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Tecnologías de la Vida	10565-018	Medios: Medio de cultura NPC
			Formulación y notas: 492.5 mL
100x vitaminas N2	Tecnologías de la Vida	17502-048	Medios: almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes
			Formulación y notas: 5 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
Neurobasal A	Tecnologías de la Vida	10888-022	Medios de comunicación: Medio de cultura ESN
			Formulación y notas: 482.5 mL
50 vitaminas B27	Tecnologías de la Vida	17504-044	Medios: almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 mes
			Formulación y notas: 10 mL
200 mM de L-Alanil-L-Glutamina	ATCC	30-2115	5 mL
100x antibióticos	Sigma-Aldrich	A5955	2.5 mL
5-fluoro-2'-desoxiuridina (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Medios: 2000x Inhibidores mitóticos alícuotas y almacenamiento a -20 °C
			Formulación y notas: dd 150 mg 5FDU y 350 mg uridina a 10 mL Neurobasal A. Filtro estéril, alícuota y congelación. Utilice 2000x en el medio de cultivo ESN.
uridina	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express Tripsina	Tecnologías de la Vida	12605-010	Medios de comunicación: Varios
			Formulación y notas: almacenar en RT
Dmso	Sigma-Aldrich	D8418	tienda en RT
Inhibidor de la tripsina de la soja (ITS)	Sigma-Aldrich	T6414	almacenar a -20 °C
etanol	Sigma-Aldrich	E7023	tienda en RT
ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A4403	Prepare 100 mM de caldo disolviendo 100 mg de ácido ascórbico en 5,7 mL de mezcla 50:50 de DMSO/etanol.
Ácido retinoico (AR)	Sigma-Aldrich	R2625	Resuspender 15 mg de AR en 9 mL 50:50 DMSO/etanol. Complementar con 1 mL de 100 mM de caldo de ácido ascórbico. Alícuota y almacenado a -80 °C. Estable durante 6 meses.
Tabla 2. Niebla
NaCl	Sigma-Aldrich	71386	Medios: Búfer de grabación extracelular
			Concentración final (mM): 58.44
			MW: 140
Kcl	Sigma-Aldrich	60135	Medio: (ERB; pH = 7,3, 315 mO)
			Concentración final (mM): 74.56
			MW: 3,5
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139	Medio: Estable a 4 °C durante al menos 6 meses.
			Concentración final (mM): 119.98
			MW: 1,25
CaCl2	Sigma-Aldrich	21115	Concentración final (mM): 110.98
			MW: 2
MgCl2	Sigma-Aldrich	63069	Concentración final (mM): 95.21
			MW: 1
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G8644	Concentración final (mM): 180.16
			MW: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Concentración final (mM): 238.3
			MW: 10
K-gluconato	Sigma-Aldrich	Página 1847	Medios: Tampón de grabación intracelular
			Concentración final (mM): 234.5
			MW: 140
NaCl	Sigma-Aldrich	71386	Medio: (IRB; pH = 7,3, 320 mO)
			Concentración final (mM): 58.44
			MW: 5
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Medio: Estable a 4 °C durante al menos 6 meses.
			Concentración final (mM): 507.18
			MW: 2
Li-GTP	Sigma-Aldrich	G5884	Concentración final (mM): 523.18
			MW: 0,5
CaCl2	Sigma-Aldrich	21115	Medio: Estable a 4 °C durante al menos 6 meses.
			Concentración final (mM): 110.98
			MW: 0,1
MgCl2	Sigma-Aldrich	63069	Medio: Estable a 4 °C durante al menos 6 meses.
			Concentración final (mM): 95.21
			MW: 1
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	380.35 Medio: Estable a 4 °C durante al menos 6 meses Concentración final (mM): 380.35 MW: 1
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Medio: Estable a 4 °C durante al menos 6 meses.
			Concentración final (mM): 238.3
			MW: 10
Bicucullina	Tocris	Artículo 131	Medios de comunicación: Varios
			Concentración final (mM): 0.01
			MW: 417,85
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Concentración final (mM): 0.01
			MW: 276,12
Tetrodotoxina	Sigma-Aldrich	A8001	Concentración final (mM): 0.005
			MW: 645,74
BoNT/A-/G	Metabiológicos	N/A	Medio:
			Concentración final (mM): TBD
			MW: 150.000
Toxina tetánica	Sigma-Aldrich	T3194	Concentración final (mM): TBD
			MW: 150.000
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2	Concentración final (mM): N/A
			MW: N/A
Tabla 3. Equipos y software
MiniAnalysis (versión 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	N/A	Software de detección de eventos
Igor Pro (versión 6.22A)	Métricas de onda	N/A	Software para la visualización de grabaciones
Maestro de parches	Heka	N/A	Software de adquisición de datos
Microscopio invertido Olympus IX51	Olimpo	N/A
Micromanipulador	Instrumento Sutter	MPC-365
Amplificador de abrazadera de parche	Heka	ECB10USB
Extractor de micropipetas	Instrumento Sutter	P-1000
Tubos capilares de borosilicato	Instrumento Sutter	B150-86-10	Corning 7740
Cubreobjetos de vidrio de 18 mm	pescador	12-545-84
Limpiador de plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Filtro de células (40 μm)	pescador	08-771-1
Agitador Stovall Danza del Vientre	pescador	Teléfono 15-453-211
Platos de baja adherencia	pescador	05-539-101	Corning 3262
Placas bacterianas	VWR	25384-302	100 x 15 mm