Producción y purificación de anticuerpos recombinantes a partir de células de mamíferos

Resumen

Fuente: Shivange, Gururaj, et al. Análisis de la distribución tumoral y tisular del anticuerpo terapéutico específico del antígeno diana. J. Vis. Exp.(2020).

El video explica el proceso de producción de anticuerpos en células huésped de mamíferos, desde la expresión génica hasta la secreción. Implica la transcripción, la traducción, el reconocimiento de señales, el plegamiento correcto y la eventual liberación en el medio extracelular a través de vesículas secretoras.

Protocolo

1. Expresión y purificación de anticuerpos

1. Mantenimiento de células CHO
   1. Cultive células CHO en FreeStyle CHO Media complementado con 1x suplemento de glutamina disponible en el mercado a 37 °C agitando a 130 rpm con 5% de CO₂ utilizando matraces Erlenmeyer largos, ya sea de vidrio o desechables.
      nota: Se recomienda encarecidamente utilizar un matraz deflector con tapón ventilado para aumentar la agitación y mejorar la transferencia de gas durante las condiciones de agitación. Se ha obtenido una reducción significativa del rendimiento de anticuerpos con matraces regulares (sin deflectores) debido a la agitación limitada del cultivo en suspensión.
   2. Mantenga el número de células entre 1-5 x 10⁶ células/ml con una viabilidad celular del >95%. Si el número de células aumenta más de 5 x 10⁶ células/mL, divida las células. Nunca permita que las células CHO alcancen menos de 0,2 x 10⁶ células/mL.
2. Transfección de células CHO
   1. Cultive células CHO en 200 mL de medio (2 x 10⁶ células/mL) en matraces deflectores Erlenmeyer largos.
      nota: Los cultivos en suspensión cultivados en matraces con deflectores siempre han producido mayores rendimientos de proteínas en comparación con cuando se cultivan en matraces sin deflectores.
   2. En un tubo de 15 mL, tome 5 mL de medio CHO FreeStyle y agregue 50 μg de ADN del clon VH y 75 μg de ADN del clon VL. Vórtice para mezclar bien.
   3. Incubar la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 5 min.
      nota: Una incubación más larga reduce los rendimientos de proteína.
   4. Agregue 750 μL de caldo de polietileneimina (PEI) de 1 mg/mL a la solución de ADN y vórtice agresivamente la mezcla durante 30 s. Incube a temperatura ambiente durante 5 min.
      adicionales nota: El PEI debe elaborarse fresco. El ciclo de congelación y descongelación múltiple de PEI reduce significativamente el rendimiento general.
   5. Agregue toda la mezcla de ADN y PEI a las células mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente los matraces deflectores Erlenmeyer delong con las células a 37 °C agitando a 130 rpm.
3. Expresión
   NOTA: El anticuerpo tiene un péptido señal secretor diseñado para su extremo N-terminal, que ayuda a que los anticuerpos se secreten en los medios.
   1. Cultive las células transfectadas a 37 °C, agitando a 130 rpm el día 1.
   2. El día 2, agregue 2 mL de agente antiaglomerante 100x y 2 mL de solución antibacteriana-antimicótica 100x. Cambie el matraz a una temperatura más baja (32-34 °C), agitando a 130 rpm.
   3. Cada quinto día, agregue 10 mL de alimento de triptona N1 y 2 mL de suplemento de glutamina 100x.
   4. Siga contando las células cada tres días con un hemocitómetro después de teñir una alícuota de células con una tinción de azul de tripano. Asegúrese de que la viabilidad de la célula se mantenga por encima del 80%.
   5. En el día 10 u 11, coseche el medio para la purificación de anticuerpos. Centrifugar el cultivo a 3000 x g, 4 °C durante 40-60 min y, a continuación, filtrar los medios transparentes con filtros de botella de 0,22 μM.
4. Purificación
   nota: La purificación de anticuerpos se realiza utilizando una columna de proteína-A disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales), utilizando una bomba peristáltica.
   1. Equilibrar la columna con un volumen de dos columnas de tampón de unión (20 mM de fosfato sódico a pH 7,4).
   2. Pase el medio filtrado que contiene el anticuerpo (obtenido en el paso 1.3.5) a través de la columna a un caudal de 1 mL/min.
   3. Lave la columna con un volumen de dos columnas de tampón de encuadernación.
   4. Eluir el anticuerpo en fracciones de 500 μL utilizando un tampón de elución de 5 mL (acetato de sodio de 30 mM a pH 3,4).
   5. Neutralizar el pH del anticuerpo eluido añadiendo 10 μL de tampón de neutralización (acetato de sodio 3 M a pH 9) por fracción.
      nota: Las fracciones 3-6 contienen la mayor parte del anticuerpo. Es aconsejable conservar todas las fracciones en caso de que el anticuerpo se eluya en una fracción posterior a la esperada.
   6. Mida la concentración de anticuerpos purificados utilizando un espectrofotómetro seleccionando el protocolo predeterminado para IgG. La concentración final del anticuerpo se obtiene en mg/mL considerando el peso molecular y el coeficiente de absorción.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios FreeStyle CHO	Tecnologías de Gibco Life	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Tecnologías de Gibco Life	Cat # 15240-062
Agente antiaglomerante	Tecnologías de Gibco Life	Cat # 01-0057DG
Jeringa de insulina BD	BD BioCiencias	Gato #329420
Pinza IVIS Spectrum	PerkinElmer	Gato #124262
CHO CD EfficientFeed B	Tecnologías de Gibco Life	Gato #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugada IgG antihumana (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Tecnologías de Gibco Life	Cat # 35050-061
Kit HiPure Plasmid Maxiprep	Invitrogen	Cat # K21007
Columna HiTrap MabSelect SuRe	GE Cuidado de la Salud	Cat # 11-0034-93
Isoflurano, USP	Codicia	Cat # 11695-6777-2
Ungüento lubricante para los ojos	Actualizar Lacri-Lube	Gato #4089
Reactivo de transfección de PEI	Termo Fisher	Gato # BMS1003A
Modelos experimentales: Líneas celulares
Humano: OVCAR-3	Colección de Cultura Tipo-Americana	ATCC HTB-161
Humanos: células CHO-K	Estable transformado en nuestro laboratorio	ATCC CCL-61
Ratón: 4T1	Amable regalo del Dr. Chip Landen, UVA
Ratón: MC38	Amable regalo de la Dra. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Autenticado por la generación de perfiles STR