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1. Expresión de hemaglutinina del virus de la influenza a través de la transfección
- Placa de células de riñón embrionario humano (HEK 293T) a una densidad de 2 x 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido blanco y déjela reposar durante 4 h en una incubadora a 37 °C (con 5% de CO2).
- Transfectar células con 100 ng de ADN que codifica para hemaglutinina viral y 0,2 μL de reactivo de transfección por pocillo en un volumen total de 50 μL.
nota: Tanto el plásmido como el reactivo transfectante se diluyen en 1x Opti-Minimum Essential Media (MEM) Reduced Serum Medium.
- Después de incubar las placas en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 18 h, retire los medios de transfección.
>2. Evaluación de la activación mediada por FcRg/NFAT de la actividad de la luciferasa por anticuerpos monoclonales o sueros
- En primer lugar, sustituya el medio de crecimiento de las células transfectadas por 25 μL de medio de ensayo (1x RPMI 1640 suplementado con sueros bovinos fetales de IgG al 4% (vol/vol)).
- En una placa separada de 96 pocillos, realice diluciones cuádruples de los anticuerpos de interés a partir de 30 μg/mL utilizando el medio de ensayo. Realice diluciones por triplicado, y en la Figura 1A se ilustra un ejemplo de diseño de placa. Asegúrese de que se incluya un control que excluya anticuerpos (sin control de anticuerpos) y un control de fondo (solo tampón de ensayo)
nota: Tanto para los controles "sin anticuerpos" como para los controles de fondo, añada 25 μL de tampón de ensayo en lugar del anticuerpo.
- Transfiera 25 μL de los anticuerpos diluidos en serie del paso 2.2 a los pocillos correspondientes en la placa de células transfectadas.
- Incubar la placa en una incubadora a 37 °C (con 5% de CO2) durante 15 min.
- Añadir 25 μL de la célula Jurkat efectora modificada apropiada que exprese FcgRIV murino o FcgRIIIa humano (75.000 células/pocillo). El volumen total de cada pocillo debe ser de 75 μL, y la concentración final inicial del anticuerpo es de 10 μg/mL (Figura 1B)
nota: Para el control de fondo, añada 25 μL de tampón de ensayo en lugar de células efectoras. Para examinar la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos, se puede utilizar una célula Jurkat modificada que expresa el FcgRIIa humano.
- Incubar la placa en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 6 h.
- Descongele y caliente el tampón de sustrato de luciferasa en agua a 37 °C durante aproximadamente 1 h antes de usar.
nota: Para hacer el tampón de sustrato de luciferasa, reconstituya el sustrato de ensayo de luciferasa liofilizado en el tampón de ensayo proporcionado. El tampón de sustrato reconstituido puede almacenarse entre -30 °C y -10 °C durante un máximo de seis semanas.
- Agregue 75 μL/pocillo de tampón de sustrato de luciferasa a todos los pocillos, excepto al control de fondo.
- Leer en un luminómetro.
- Calcule la inducción de pliegue con la siguiente ecuación: Inducción de pliegue = (Valor inducido-Valor de fondo) / (Sin valor de mAb-Valor de fondo).
