NOTA: Los anticuerpos específicos de HA que inhiben la replicación viral generalmente se pueden clasificar en i) los que se unen en o adyacentes al sitio de unión del receptor en la parte superior de la cabeza globular y ii) los que se unen distal del dominio de unión al receptor, que incluye el lado lateral de la cabeza globular y la región del tallo del HA. Los anticuerpos que se dirigen al sitio de unión del receptor evitan el compromiso de motivos de ácido siálico en la superficie de las células diana y pueden medirse mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI). Los anticuerpos que son HI-negativos, como los anticuerpos específicos del tallo, aún pueden inhibir la replicación viral, pero solo se pueden evaluar mediante ensayos de neutralización.
1. Categorización de anticuerpos en función de las actividades de HI
- Ensayo HI
- En una placa inferior en V de 96 pocillos, agregue 25 μL de 1x PBS en las columnas 2 a 12.
- Diluir el anticuerpo monoclonal (mAb) 7B2 (específico de la cabeza), 6F12 (específico del tallo) y un control de isotipo a 100 μg/mL en 1x PBS y 50 μL de las preparaciones de anticuerpos diluidos en la columna 1. Además, incluya un control sin mAb mediante la adición de 50 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (Figura 1A).
- Realice diluciones seriadas 2 veces de los anticuerpos transfiriendo 25 μL de la columna 1 a la columna 2, y así sucesivamente. Deseche los últimos 25 μL de la columna 12 (Figura 1A).
nota: Asegúrese de incluir una fila de control sin anticuerpos.
- Diluir el stock de virus (un virus reordenado que expresa la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de A/California/04/09 con los segmentos internos de A/Puerto Rico/8/34) a 8 unidades de hemaglutinación/25 μL de stock de virus diluido. Añadir 25 μL del caldo de virus diluido (8 hemaglutinaciones) a cada pocillo (filas de la A a la G).
nota: La mezcla de anticuerpos y virus debe tener un volumen final de 50 μL con una concentración final inicial de 50 μg/mL.
- Incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 45 min.
- Para la fila de valoración inversa (H), agregue 50 μL de PBS 1x en los pocillos H2 a H12. Añadir 100 μL de las 8 unidades de hemaglutinación/25 μL al pocillo H1. Diluir en serie dos veces transfiriendo 50 μL de H1 a H2, y así sucesivamente. Deseche los últimos 50 μL del pocillo H12. Finalmente, agregue 50 μL de glóbulos rojos de pollo (RBC) al 0,5% a todos los pocillos de la placa inferior en V de 96 pocillos.
nota: Las muestras de mAb en el ensayo deben tener un volumen final de 100 μL: mAb (25 μL), virus (25 μL) y RBC (50 μL). El volumen final del control sin mAb debe contener 25 μL de 1x PBS, 25 μL de virus y 50 μL de RBC.
- Incubar la placa a 4 °C durante 1 h.
- Leer visualmente las placas para la actividad de HI. Si hay una lectura positiva para un anticuerpo en particular, continúe con el paso 2.1 para generar variantes de escape. Si el anticuerpo es HI-negativo, continúe con el paso 1.2 para evaluar si el anticuerpo tiene actividad neutralizante en un ensayo de cultivo celular.
nota: Una lectura positiva de un mAb altamente activo se indica mediante una bolita de RBC de color rojo oscuro en el centro de un pocillo (Figura 1B; 7B2) que formará una lágrima cuando la placa inferior en V de 96 pocillos se mantenga en un ángulo de 45°. Una lectura negativa no formará una bolita de glóbulos rojos de color rojo oscuro en el pocillo (Figura 1B; 6F12 y sin mAb). El control del isotipo tampoco formará una pastilla de glóbulos rojos de color rojo oscuro y debe tener un aspecto idéntico al anticuerpo específico del tallo, el 6F12 o la muestra de control sin mAb (Figura 1B).
>2. Generación de variantes mutantes de escape
NOTA: Los anticuerpos neutralizantes que tienen o carecen de actividad HI se analizan más a fondo con los protocolos específicos que se describen a continuación.
- Protocolo 1: Anticuerpos HI-positivos/Neutralización positivos (Figura 2A)
- Prepare un stock de virus de 106 unidades formadoras de placas/mililitro (PFU/mL) en 1x PBS en un volumen de 400 μL.
- Prepare cuatro diluciones del anticuerpo de interés en concentraciones crecientes (por ejemplo, 0, 0,5, 0,05 y 0,005 mg/mL) en 1x PBS en un volumen de 100 μL por dilución.
NOTA: Los virus de tipo salvaje siempre deben pasar en paralelo y en ausencia de anticuerpos. Las secuencias de estos virus transmitidos ayudarán a distinguir entre la adaptación a las condiciones de cultivo celular y las mutaciones de escape.
- Mezclar 100 μL de 106 PFU/mL de virus con 100 μL de cada dilución de anticuerpo o 100 μL de 1x PBS.
- Incubar durante 1 h en una incubadora a 37 °C (con 5% de CO2). Vórtice brevemente. Inyecte 200 μL de cada mezcla en huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos (SPF).
- Incubar los huevos a 37 °C (sin CO2) durante 40-44 h.
- Sacrificar los huevos embrionados infectados por el virus incubándolos a 4 °C durante un mínimo de 6 h.
- Recolecta el líquido alantoideo de los huevos, como se describió anteriormente.
- Realice el ensayo de hemaglutinación, como se describió anteriormente. Si todas las preparaciones de líquido alantoideo no tienen títulos de hemaglutinación, repita desde el paso 2 con diluciones de anticuerpos que oscilan entre 0,005 mg/mL y 0,00005 mg/mL.
nota: Una concentración saturada de un anticuerpo HI-positivo puede neutralizar todas las partículas virales presentes. Por lo tanto, puede ser necesario disminuir la cantidad de anticuerpos presentes en el paso.
- Confirme las variantes de escape realizando el ensayo HI (paso 1.1).
nota: Los anticuerpos HI-activos bloquean la participación de HA de motivos de ácido siálico en las células diana. Por lo tanto, un virus en presencia de su anticuerpo afín pierde la capacidad de aglutinar glóbulos rojos (presencia de glóbulos rojos). Teóricamente, las variantes de escape de los anticuerpos HI-activos aún pueden unirse a motivos de ácido siálico incluso en presencia de su anticuerpo afín y, por lo tanto, pueden aglutinar glóbulos rojos (sin gránulos de glóbulos rojos). Si el IH del anticuerpo de interés sigue siendo detectable, repita el protocolo del paso 2.1.2 con una concentración inicial más alta del anticuerpo.
