Generación de anticuerpos monoclonales recombinantes a partir de cultivos de células de mamíferos

Resumen

Fuente: Nogales-Gadea, G. et al., Generación de anticuerpos monoclonales IgG humanos recombinantes a partir de células B clasificadas inmortalizadas.J. Vis. Exp.(2015)

Este video muestra un método de generación de anticuerpos a partir de células de mamíferos mediante la introducción de vectores plásmidos con genes de cadena pesada y ligera. Estos vectores interactúan con la polietilenimina y entran en las células formando poliplexos; Más tarde, se traducen en proteínas individuales y se ensamblan en anticuerpos completos, que se secretan en el medio extracelular.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)

1. Centrifugar 25 ml de la sangre heparinizada de los participantes a 900 x g durante 15 min, tan pronto como sea posible después de la extracción de la sangre. Si hay menos sangre, reduzca la escala de los reactivos en consecuencia. Realice todos los siguientes pasos en una capucha.
2. Transfiera el suero a un tubo limpio. Se puede utilizar en pasos posteriores para congelar PBMC o, en el caso de pacientes autoinmunes, para probar autoanticuerpos.
3. Diluya la sangre con 10 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 y vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
4. Añadir 15 ml de una solución que contenga polisacarosa y diatrizato sódico (1,077 g/ml) en un nuevo tubo de 50 ml.
5. Coloque suavemente la sangre sobre la solución en el paso 1.4 acercando las dos aberturas de los tubos hasta que los dos líquidos entren en contacto muy lentamente, y luego decantar lentamente la suspensión de PBMC sobre el tubo de 50 ml. Este paso es fundamental para tener una buena separación de los PBMC.
6. Centrifugar el tubo obtenido en el paso 1.5 a 400 x g sin freno a temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
7. Después de la centrifugación, recupere con la pipeta el anillo blanco que aparece en la parte media del tubo, que contiene las PBMC.
8. Lave las células con 25 ml de medios RPMI 1640.
9. Centrifugar 300 x g a RT durante 10 min.
10. Deseche el sobrenadante y lave las células con 10 ml de RPMI 1640. Vuelva a centrifugar como en el paso 1.9.
11. Cuente los PBMC con una cámara de Neubauer como se informó anteriormente.
12. Procese las PBMC como se indica en la sección 2 o guárdelas para su uso posterior de la siguiente manera: 10 millones de PBMC para congelación por tubo Cryovial diluido en 1 ml de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 90% de suero obtenido en el paso 1.2. Congelar progresivamente y durante mucho tiempo en nitrógeno líquido.

>2. Tinción de PBMCs para la clasificación de CD22+ e inmunoglobulina G (IgG+) por citometría celular

1. Colocar las PBMC en un matraz de cultivo celular de 25^cm2 con 6 ml de medio RPMI 1640 completo (suplementado con L-glutamina, 10 mM de tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetinasulfónico (HEPES), 50 U/ml de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina y 10% de suero fetal bovino) y dejar que recuperen O/N en la incubadora a 37 °C con un 5% de dióxido de carbono (CO₂).
2. Bloquee los tubos estériles de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) con solución salina tamponada (PBS) estéril de fosfato de albúmina al 4% durante la noche (O/N). Lave los tubos dos veces con PBS y llénelos con 500 μl de medio RPMI 1640 completo. Utilice estos tubos para recuperar las células después de la clasificación.
3. Recoja las PBMC en un tubo y centrifugue a 400 x g a RT durante 5 min.
4. Vuelva a suspender las celdas en el búfer de etiquetado (consulte los pasos 2.5 y 2.6) y cuéntelas. El tampón de etiquetado es estéril al 2% de suero fetal bovino y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS.
5. Prepare 3 tubos FACS con 10⁵ células cada uno y vuelva a suspenderlos en 100 μl de tampón de etiquetado. Estos tubos servirán para definir las compuertas de la clasificación.
   1. En el primer tubo añadir 5 μl de anticuerpo anti CD22 PerCP (recomendado en la ficha técnica del fabricante), en el segundo tubo 20 μl de anti IgG PE (recomendado en la ficha técnica del fabricante) y nada en el tercer tubo. Incubar en hielo y en oscuridad durante 30 min.
6. Resuspender 5 millones de células en 200 μl de tampón de marcaje en un tubo FACS y añadir 10 μl de anti CD22 PerCP y 40 μl de anti IgG PE. Incubar las células en hielo y oscuridad durante 30 min. Si se desea clasificar un mayor número de células, escale verticalmente todos los reactivos.
7. Celdas de centrífuga a 400 x g con un freno bajo durante 5 min en RT.
8. Decanta suavemente el sobrenadante.
9. Vuelva a suspender las células en 500 μl de tampón de marcado. Centrifugar las celdas a 400 x g con un freno bajo durante 5 min en RT. Repita los pasos 2.7 y 2.8
10. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en 300 μl de medio completo RPMI.
11. Pase las células a través de un filtro de 0,45 μm. Las celdas están listas para ordenar.

>3. Clasificación de las células B CD22+ e IgG+

1. Utilice 3 tubos de control para establecer la viabilidad de las células. En el control sin tinción, utilice el diagrama de dispersión hacia adelante y por tamaño para definir la activación de los linfocitos. Los controles con el CD22 PerCP y el PE anti-IgG sirven para establecer las puertas y la puerta de clasificación. Realice lo siguiente de los datos informados anteriormente.
   NOTA: Una puerta es un conjunto de límites de valor (fronteras) que sirven para aislar un grupo específico de eventos citométricos, en nuestro caso celdas, de un conjunto grande. En el caso de una puerta de clasificación, los límites de valores permiten la recuperación de los eventos citométricos, celdas, que se encuentran dentro de los límites definidos: CD22+ e IgG+.
2. Como tubo colector en la clasificación, utilice los tubos bloqueados con 500 μl de medio RPMI 1640 completo, obtenido del paso 2.2.
3. Proceda a ordenar doble positivo: CD22+ IgG+. NOTA: el número final de celdas en cada condición. Coloque las celdas clasificadas en placa encima de las celdas de alimentación lo antes posible.

>4. Irradiación de las células alimentadoras

NOTA: Realice la preparación de las celdas del alimentador entre 1 y 3 días antes de la clasificación. Se necesitan al menos 5.000 celdas wi38 por pocillo en una placa de 96 pocillos redondos. Realice los pasos 4.1, 4.2 y 4.4 en un capó.

1. Cultive las celdas wi38 a 37 °C y 5% de CO₂ en medio RPMI 1640 completo (igual que para las PBMC) hasta alcanzar el número deseado de celdas.
2. Irradiarlos a 50 Grays, siguiendo un protocolo descrito anteriormente. Realizar la irradiación una vez que las células wi38 se hayan tripsinizado y resuspendido en medio RPMI completo, o con wi38 adherido al matraz de cultivo y tripsinizado después de la irradiación. Siga el método de tripsinización indicado por el proveedor de las células wi38. Irradiar el número de células necesarias para cubrir los pocillos necesarios para la siembra de células B IgG+ (1% del total de PBMC contabilizado en el paso 1.11).
3. Placa de 90 μl que contiene 5.000 células wi38 irradiadas en cada pocillo de la placa redonda de 96 pocillos. Deje vacíos los pocillos en la fila exterior de la placa (porque se evaporan más rápido) y solo use los 60 pocillos en el medio de la placa para enchapar las celdas. Llene los pocillos exteriores que enmarcan la placa con 200 μl de PBS.
4. Colóquelos en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂, hasta que los necesite.

>5. Enchapado de PBMC clasificados, infección por el virus de Epstein-Barr (VEB) y crecimiento

1. Diluya las PBMC clasificadas, para colocar 50 celdas en 50 μl de medio completo RPMI 1640 por pocillo en la placa de 96 pocillos redondos (previamente plateada con celdas irradiadas wi38). Realice los pasos en una campana equipada para el trabajo con EBV.
   NOTA: la infección de 50 células por pocillo se optimiza y aumenta la probabilidad de producir un anticuerpo monoclonal, sin embargo, se recomienda verificar esto mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describió anteriormente.
2. Agregue 60 μl de sobrenadante de EBV (que contiene 3 - 4 x 10⁸ copias virales/ml) a cada pocillo en la placa de 96 pocillos redondos. Se debe tener PRECAUCIÓN durante el trabajo con EBV.
3. Añadir 1 μg/ml de CpG (ODN2006) por pocillo.
4. Deje las células en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
5. Monitoree visualmente el crecimiento del clon bajo el microscopio después de una semana.
   NOTA: Algunos ejemplos de crecimiento de células B se pueden ver a continuación en la sección de resultados. Tenga en cuenta que las tasas de crecimiento de los clones pueden variar, y puede ser necesario tiempo adicional para comenzar a ver algo de masa celular creciendo en el medio del pozo.
6. Después de las primeras dos semanas, monitoree el crecimiento del clon bajo el microscopio óptico y proceda al primer intercambio de medios. Pipetear lentamente 90 μl de medio desde la parte superior del pocillo y recogerlo en una placa limpia de 96 pocillos. (Las células B se encuentran en el fondo del pozo, por lo que no hay riesgo de aspirarlas).
   1. Añadir a cada pocillo 100 μl de medio RPMI 1640 completo suplementado con 1 μg/ml de CpG (ODN2006) y 50 U/ml de IL2. Si los clones están creciendo, analice este primer intercambio de medios mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) como en el paso 6.
7. Controle el crecimiento de los clones y cambie el medio después de la^3ª y la^4ª semana de crecimiento de nuevo tomando 90 μl de medio y añadiendo 100 μl de medio RPMI 1640 completo suplementado con 1 μg/ml de CpG (ODN2006) y 50 U/ml de IL2. Utilice el sobrenadante recolectado para monitorear la producción de IgG por ELISA como en el paso 6.
   NOTA: Después de un mes, el crecimiento del clon debe ser evidente al observar los agregados de células redondas que generalmente se encuentran en el medio del pozo de fondo redondo.
8. En este paso, cambie los medios de la misma manera que las semanas anteriores, pero solo con medios RPMI 1640 completos. Un buen indicador para saber cuál es el momento adecuado para cambiar de medio es el color del medio, si se está volviendo amarillento las células necesitan un intercambio de medios.
9. Cuando las placas de 96 pocillos contengan clones grandes (aproximadamente 5 x 10⁵ células), transfiéralos a un pocillo plano de una placa de 24 pocillos. Añada 300 μl de medios RPMI 1640 completos al nuevo pocillo. Vuelva a suspender el clon en crecimiento de 96 pocillos, pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, y transfiera las células al nuevo pocillo, distribuyéndolas homogéneamente. Agregue nuevos medios cuando sea necesario.
   1. Cuando los pocillos de la placa de 24 pocillos estén llenos de celdas (aproximadamente 5 x 10⁶ celdas), transfiéralo a un pocillo plano de una placa de 6 pocillos. Añada 2 ml de medios RPMI 1640 completos al nuevo pocillo. Vuelva a suspender las células en la placa de 24 pocillos pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces, y distribúyalas homogéneamente en el nuevo pocillo.
10. Agregue medios cuando sea necesario. Si las células no se van a mantener en cultivo, granule las células a 400 x g durante 5 min en RT. Guarde los sobrenadantes para la prueba ELISA. Lavar el pellet de células una vez con 1 x PBS, centrifugar de nuevo a 400 x g durante 5 min, y almacenar en seco a -80 °C hasta la extracción del ARN.
    1. Cuando las células de la placa de 6 pocillos se vuelvan confluentes (aproximadamente 20 x 10⁶ células), transfiéralas a una placa de cultivo de 60 mm. Añada 4 ml de soporte RPMI 1640 completo a la nueva placa. Vuelva a suspender las células en una placa de 6 pocillos y transfiérelas a medida que se hacen en los pasos 5.9 y 5.10.
11. Agregue nuevos medios cuando sea necesario. En este paso, congele las células a 10 – 30 millones/ml en un 90% de suero fetal de ternero y un 10% de DMSO. Si se desean mayores cantidades de células, continúe la expansión de los clones en placas de superficie más grandes.

>6. ELISA para la detección de anticuerpos IgG

1. Dispensar 50 μl/pocillo en una placa ELISA de anticuerpo F(ab)₂ Fc humano de cabra diluido 1 200 en tampón de recubrimiento. El tampón de recubrimiento contiene 50 mM de carbonato de sodio (_Na2, CO₃), pH 9,6.
2. Selle las placas con una etiqueta de plástico e incube 1 hora a 37 °C. Alternativamente, incube a 4 °C O/N.
3. Lavar cada pocillo 6 veces con 200 μl de tampón de lavado. El tampón de lavado contiene 0,05% de Tween-20 en 1 x PBS. No toque ni rasque la superficie del pocillo donde se ha unido el anticuerpo.
4. Bloque con tampón de bloqueo, 100 μl/pocillo. El tampón bloqueante contiene un 4% de leche en polvo descremada en PBS. Selle la placa e incube 1 hora a 37 °C.
5. No lavar. Deseche el tampón de bloqueo y golpee el plato 3 veces boca abajo sobre una toalla de papel para eliminar el líquido residual.
6. Incubar los sobrenadantes y patrones de los clones.
   1. Para una primera prueba, diluya los sobrenadantes clonales obtenidos en el paso 5.6 o 5.7 1/3 en RPMI. Para los estándares, diluya con la solución de IgG humana del medio RPMI para obtener: 1.000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,6 ng/ml y blanco. Utilice 50 μl/pocillo e incube a 37 °C durante 60 min. Analice diluciones adicionales del sobrenadante del clon para probar la afinidad del anticuerpo, como 1/10 o 1/100.
7. Lavar como se hizo en el paso 6.3.
8. Utilice 50 μl/pocillo de peroxidasa F (ab)2 anti-IgG Fc humana peroxidasa conjugada diluida 1:20.000 en el tampón de incubación. El tampón de incubación contiene un 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y un 0,02% de Tween 20 en 1x PBS. Incubar a 37 °C durante 60 min.
9. Lavar como se hizo en el paso 6.3.
10. Añadir 100 μl/pocillo de solución de sustrato que contenga un 0,1% de 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina (TMB). Incubar 10 min hasta que se forme un color azul estable en los pocillos. Ten cuidado; ¡No esperes demasiado!
11. Detenga la reacción añadiendo 50 μl de ácido sulfúrico 2 M (_H2,_SO4). Mida la absorción a 450 nm, dentro de los 30 minutos posteriores a la detención de la reacción.
    NOTA: Todos los sobrenadantes de los clones con 3 desviaciones estándar sobre el blanco se considerarán positivos para anticuerpos humanos IgG. Para la confirmación de los clones positivos, este ELISA debe repetirse al menos tres veces en diferentes sobrenadantes del mismo clon. Además, para descartar la posibilidad de reactividad cruzada inespecífica, se recomienda asegurar que no haya señal cuando los sobrenadantes se incuban en pocillos no recubiertos pero bloqueados. En este paso, se puede realizar un ensayo de detección para detectar la especificidad antigénica de los anticuerpos de interés antes de pasar a la sección 7.

>7. Aislamiento de ARN y síntesis de ADN complementario de primera cadena (ADNc) de los clones productores de IgG

1. Tan pronto como la producción de IgG sea confirmada por ELISA, extraiga el ARN del clon.
2. Para extraer ARN de células en crecimiento en los pasos 5.7 o 5.9, utilice el kit de síntesis directa de ADNc de células superíndice III, que permite obtener ADN de 10.000 células por célula.
3. Para extraer ARN de grandes cantidades de células, o de la pelletza almacenada en el paso 5.11, utilice el kit de aislamiento de ARN de alta pureza. Otros sistemas de extracción de ARN también pueden ser adecuados en este paso. Siga las instrucciones del fabricante.
4. Para los números de celda comprendidos entre 1 x 10⁶ y 1 x 10⁴, utilice el sistema de transcripción inversa, siguiendo las instrucciones del fabricante. También se pueden utilizar otros sistemas para la síntesis de ADNc de primera cadena.

8.^1ª y^2ª PCR para la amplificación de las cadenas pesadas y ligeras de los clones de células B productores de IgG

1. Con el ADNc de los clones celulares, obtenidos en los pasos 5.6 y 5.7 y positivos en el ELISA IgG en el paso 6, realizar PCR con los cebadores enumerados en la Tabla 1.
2. Configure PCR independientes para cada cadena de IgG pesada, kappa y lambda. Prepare una solución madre con cebadores directos e inversos en concentraciones iguales. Añádalos a la reacción a una concentración final de 0,4 μM.
3. Utilice 1 μl de la síntesis de ADNc para realizar la PCR 1^ST. Aquí, realice reacciones de 20 μl siguiendo las instrucciones del fabricante de Takara Taq. Alternativamente, use otras polimerasas.
4. Colocar la^1ª PCR en las siguientes condiciones de ciclo: 94 °C durante 5 min; (50 ciclos de: 94 °C durante 30 seg; 58 °C durante 30 seg. y 72 °C durante 45 seg; 72 °C durante 7 min; dejar enfriar a 4 °C. Incluir un blanco en la reacción, para detectar posibles contaminaciones.
5. Prepare 1x TBE (89 mM de Tris-borato y 2 mM de EDTA). En un volumen de 100 ml de 1x TBE, añadir 1 g de agarosa (gel de agarosa al 1%). Calienta la solución en el microondas durante aproximadamente 1 min, hasta que la agarosa se disuelva. A continuación, añadir 4 μl de bromuro de etidio de 10 mg/ml (o colorante de ADN equivalente) y mezclar.
   1. Vierta el contenido en una bandeja y espere hasta que se polimerice. Ejecute 5 μl de la mezcla de PCR en el gel para visualizar las bandas. Los fragmentos de cadena pesada deben tener alrededor de 400 a 550 pb, mientras que la cadena ligera debe tener alrededor de 300 a 400 pb. Si no se detectan las bandas, proceda igualmente a la^2ª PCR.
6. Utilice 1 μl de la primera mezcla de PCR para realizar la^2ª PCR. Utilice los mismos reactivos que en el paso 8.2 pero utilizando la mezcla adecuada de cebadores (véase la Tabla 1). Para la^2ª PCR utilizar las siguientes condiciones: 94 °C durante 5 min; (50 ciclos de: 94 °C durante 30 segundos; 56,5 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 55 segundos); 72 °C durante 7 min; Deje que se enfríe a 4 °C. Incluya un blanco en la reacción, para detectar posibles contaminaciones por PCR.
7. Prepare un gel de agarosa como se describe en 8.5. Ejecute el gel para visualizar el producto de PCR como en 8.5.1 Utilice las amplificaciones que contienen los fragmentos del tamaño correcto para la clonación en el paso 9 y produzca los anticuerpos en el paso 10.
8. Secuenciar el ADN, mediante una reacción de 10 μl que contenga: 100 ng de la^2ª PCR, 0,2 μM del cebador o mezcla de cebadores, 1 μl del terminador y 1 μl del tampón. Realice la reacción de secuenciación en las siguientes condiciones: (25 ciclos de: 96 °C durante 10 segundos; 50 °C durante 5 segundos; y hasta 60 °C durante 4 minutos); 60 °C durante 7 min; dejar enfriar a 4 °C.
9. Purifique las reacciones de secuenciación con columnas microspin G50 siguiendo las instrucciones del fabricante. Evalúe las secuencias de la ligadura en un analizador automático de secuencias como se ha descrito anteriormente. Los electroferogramas deben ser limpios y corresponder a una sola secuencia de inmunoglobulina.
   NOTA: Si los productos de PCR muestran secuencias de inmunoglobulinas poco claras o mezcladas, considere clonarlos utilizando el sistema TopoTA, para obtener secuencias aisladas y luego continuar con el paso 9.

>9. Clonación y secuenciación de las cadenas pesadas y ligeras de los clones productores de IgG

1. Prepare 1 μg de ADN de los vectores pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 y pFUSEss-CHIg-hG1.
2. Digiera estos vectores con las enzimas de restricción adecuadas. Utilice EcoRI y BsiWI para pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI y AvrII para pFUSE2ss-CLIg-hl2, y EcoRI y NheI para pFUSEss-CHIg-hG1. Utilice 3 unidades de cada enzima de restricción para 1 μg de ADN del vector.
   1. Digiera con una enzima y purifique el producto digerido con un kit de purificación de PCR. Digierir con la segunda enzima y purificar con un kit de extracción en gel (según el protocolo del fabricante). Corta el fragmento de interés del gel de agarosa. Prepare el gel de agarosa como en el paso 8.5.
3. Digiera los productos de^2ª PCR del clon de IgG en producción: EcoRI y BsiWI para la amplificación de la cadena kappa, EcoRI y AvrII para la amplificación de la cadena lambda, y EcoRI y NheI para la amplificación de la cadena pesada. Digiera con una enzima y purifique el producto digerido con un kit de purificación de PCR. Digirir con la segunda enzima y purificar el producto digerido con un kit de purificación PCR. Utilice las mismas unidades de enzimas y la misma cantidad de ADN que en el paso 9.2.
4. Libar los fragmentos de PCR en el interior de los vectores con ADN ligasa T4 a 16 °C O/N siguiendo las recomendaciones del fabricante. La relación utilizada debe ser 1 : 2 (vector : insertar).
5. Utilice 1 μl de la ligadura para transformar las bacterias DH5α. Siga las condiciones del fabricante de DH5α para la transformación. Diseminar las bacterias en placas de blasticidina o zeocina, según el tipo de vector utilizado. Incubar las placas O/N a 37 °C.
6. Cultiva colonias individuales y extrae el ADN con un kit de minipreparación, siguiendo las instrucciones del fabricante. Uso para el cultivo de una sola colonia y extracción de ADN según las recomendaciones del fabricante, del kit de minipreparación de ADN. Analícelos por digestión con las enzimas utilizadas para la preparación de vectores e insertos como en los pasos 9.2 y 9.3.
7. Secuenciar el ADN, utilizando 100 ng del vector como se hace en los pasos 8.8 y 8.9.

10. Producción de anticuerpos en células HEK

1. Cultive células HEK en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10 % de suero fetal de ternera, un 1 % de L-glucosa y un 1 % de penicilina/estreptavidina (DMEM+) hasta una confluencia del 75 % en una placa de cultivo celular de 150 mm. Realizar en un paso de capó 10.1 a 10.7.
2. Antes de la transfección, cambie el medio a medio como antes, pero sin suero de ternera fetal.
3. Para cada transfección pesada de cadena ligera, prepare una mezcla de transfección con 2,5 ml de DMEM (sin suero), 9 μg del vector con la cadena pesada, 6 μg del vector con la cadena ligera y 100 μl de solución de polietilenina (PEI) (de un stock de 1 μg/μl). Incubar en RT durante 15 min.
4. Añada suavemente 2,5 ml de la mezcla de transfección preparada en el paso 10.3 a las células HEK de la placa. Meca el plato para distribuirlo de manera homogénea.
5. Incubar las células en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 horas.
6. Cambie el medio de cultivo a medio sin suero fetal de ternero.
7. Recoja el medio de las placas 4 días después.
   NOTA: Los anticuerpos en el medio se pueden utilizar para caracterizar su reactividad in vitro e in vivo.

Tabla 1. Imprimaciones utilizadas.

1st Imprimaciones de PCR
	Delantero (5'-3')	Reversa (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTCTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTCTCTCTCTCTCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTCTGGATCTCTG
	5′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGGCCTTTTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGTGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd cebadores de PCR
	Delantero (5'-3')	Reversa (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG
	5′ EcoRI VH1 a 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 1 a 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTGTGTGTGTCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1 a 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 4 a 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT
	5′ EcoR1 Vλ 7 a 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Histopaco-1077	Sigma-Aldrich	10771	solución que contiene polisacarosa y diatrizato de sodio
Clasificador de células FACSAria II	BD Biociencias
96 placas de micropocillos con fondo en U	Coprotagonista	3799
Avanzado Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio	Gibco, Tecnologías para la Vida	12633-020
30% v/v de sobrenadante que contiene EBV de la línea celular B95-8	ATCC	CRL-1612	3,4 x 108 copias/ml
CPG2006	Invivogen	ODN 7909
Células Wi38	Sigma-Aldrich	90020107
Interleucina-2	Roche	10799068001
Placas ELISA	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra anti-humano IgG, Fcγ Fragmento específico (no conjugado)	Jackson ImmunoResearch	109-006-008
4% de leche en polvo descremada (bloqueador de grado secante)	Biorad	170-6404
IgG humana	sigma	I 2511	Inmunoglobulina purificada con IgG HUMANA, 5,6 mg/ml
IgG Fcγ humana F(ab)2 de cabra (conjugada con peroxidasa (PO))	Jackson ImmunoResearch	109-036-008
Lector de ELISA (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	2030-0050
AffiniPure Rabbit anti-Human IgM conjugada con peroxidasa, Fc5μ	Jackson ImmunoResearch	309-035-095
Sistema de síntesis directa de ADNc de células SuperScript III	Invitrogen	18080-200
Sistema de PCR GeneAm 2700 de Applied Biosystems (ABI)	Biosistemas Aplicados
Kit de aislamiento de ARN de alta pureza	Roche	11828665001
Kit de sistema de transcripción inversa	Promega	A3500
ADN polimerasa recombinante Taq	Takara	R001A
Imprimaciones (2μl)	sigma
Agarosa ultrapura	Invitrogen	16500-500
Escalera de 100 bp	Invitrogen	15628-019
Cantidad Uno 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	170-8100
Kit de purificación QIAquick PCR	QIAGEN	28106
Kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v3.1	Biosistemas Aplicados	4337455
Placa de reacción de 0,1 ml (MicroAMP Optical de 96 pocillos)	Biosistemas Aplicados	4346906
Analizador genético ABI300	Biosistemas Aplicados	4346906
Células competentes DH5α (E. coli)	Invitrogen	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 pb)	Invivogen	pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 pb)	Invivogen	pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 pb)	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 pb)	Invivogen	pfuse2ss-hcll2
Medio SOC	Invitrogen	15544-034
Medio de agar a base de LB suplementado con Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	Invivogen	fas-zn-s
Excelente medio líquido a base de caldo (TB) suplementado con zeocina (Fast-Media Zeo TB)	Invivogen	Fas-Zn-L
Kit de minipreparación de ADN	Tecnología Omega Bio	D6942-02
Nanodrop (espectrofotómetro ND1000)	Nanogota
Medio de agar a base de LB suplementado con blasticidina (Fast-Media Blast Agar)	Invivogen	fas-bl-s
Excelente medio líquido a base de caldo (TB) suplementado con blasticidina (Fast-Media Blast TB)	Invivogen	FAS-BL-L
EcoRI	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	R0101S	20.000 U/ml, en 10x NEBuffer EcoRI
NheI	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	R0131S	10.000 U/ml, en 10x NEBuffer 2.1
Escalera de ADN de 2 logaritmos	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	N3200S	0,1-10,0 kb, 1.000 μg/ml
XmaI	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	R0180S	10.000 U/ml, en 10x CutSmart Buffer
BsiWI	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	R0553S	10.000 U/ml, en 10x NEBuffer 3.1
AvrII	Biolaboratorios de Nueva Inglaterra	R0174S	5.000 U/ml, en 10x CutSmart Buffer
FastAP Fosfatasa alcalina termosensible	Termo Científico	EF0651	1 U/μL, en tampón FastAP 10x
Células competentes DH5α	Invitrogen	18263-012
Ratón PE Anti-Humano IgG	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clon: HIB22	Fisher científico	BDB563942
Kit de minipreparación QIAprep Spin	QIAGEN	27106
Terminator BigDye v3.1	Biosistemas Aplicados	4337455