Una tecnología de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales contra una metalopéptidasa

Resumen

Fuente: Xia, P., et al. Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un ensayo para producir anticuerpos monoclonales contra la aminopeptidasa porcina N (APN), una metalolopeptidasa unida a la membrana, utilizando una tecnología tradicional de hibridoma. Al inmunizar a un ratón con APN, las células del bazo se recolectan y se fusionan con células de mieloma inmortales para producir hibridomas. A continuación, los hibridomas se seleccionan y proliferan utilizando el medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) para producir anticuerpos monoclonales específicos para diferentes epítopos de APN.

Protocolo

Todos los procedimientos de modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inmunización animal

1. Por vía subcutánea (s.c.) inyecte a ratones hembra BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad, 50 μg de proteína APN o solución salina tamponada con fosfato (PBS, control negativo) mezclada con adyuvantes una vez cada 2 semanas. Use el adyuvante completo de Freund que contiene las micobacterias muertas por calor para la inmunización inicial, y el adyuvante incompleto de Freund para las inmunizaciones de refuerzo. Mezcle volúmenes iguales de proteína APN (o PBS) y adyuvante de Freund o adyuvante de Freund incompleto, respectivamente.
2. Detección de títulos de anticuerpos contra APN en los sueros de estos ratones mediante un ensayo indirecto de inmunoabsorción enzimática (ELISA) utilizando una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/mL de proteína APN diluida en 0,05 M PBS (pH 9,6).

>2. Tecnología de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales contra APN

1. Por vía intraperitoneal (i.p.) inyectar 100 μg de proteína APN en los ratones seleccionados para un refuerzo final del antígeno.
2. Tres días después, se sacrificó a los ratones con pentobarbital sódico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) y luxación cervical.
3. Recoja el bazo y lávese con DMEM dos veces para eliminar las células sanguíneas y grasas. Filtre la suspensión de células del bazo utilizando una rejilla de cobre de malla 200 para eliminar los restos de tejido, y recoja las células del bazo mediante centrifugación (1500 × g, 10 min) para eliminar la membrana del bazo.
4. Siembra células SP2/0 de mieloma de ratón en un matraz de 25^cm2 que contiene 5 mL de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 6% de suero fetal bovino (FBS) y cultivo a 37 °C, 6% de CO₂ en atmósfera para mantener la viabilidad celular. Después de 5-6 días de cultivo, las células alcanzan un 80%-90% de confluencia después de la reanimación y se encuentran en la fase de registro de crecimiento. Bajo el microscopio, las células son redondas, brillantes y claras.
5. Un día antes de la hibridación, recoja macrófagos de las cavidades peritoneales de los ratones de acuerdo con un método publicado anteriormente.
6. Siembre macrófagos peritoneales a una densidad de 0,1-0,2 × 10⁵/mL en placas de 96 pocillos, cada pocillo que contenga 100 μL de medio HAT (DMEM suplementado con 10% de FBS y 1x suplemento de HAT), e incube a 37 °C, 6 % de_CO2 en atmósfera humidificada durante la noche.
7. Para la hibridación, aspire suavemente las células SP2/0 con una pipeta de 8 a 10 frascos y suspenda en 10 ml de medio DMEM sin suero. Lave las células con DMEM nuevo, centrifugue (1500 × g, 10 min) dos veces y luego vuelva a suspender en 10 mL de DMEM.
8. Mezcle las células del bazo cuantificadas con las células SP2/0 en una proporción de 10:1 y transfiéralas a tubos de 50 mL. Centrifugar (1500 × g, 10 min) y desechar el sobrenadante. Recoja los gránulos de celda en la parte inferior de los tubos y golpee con la palma de la mano para aflojar los gránulos antes de la hibridación.
9. Añadir 1 mL de polietilenglicol 1500 (PEG 1500), precalentado a 37 °C, gota a gota con un gotero al pellet de celda aflojado durante un período de tiempo de 45 s mientras se gira suavemente el fondo del tubo.
10. Añada lentamente 1 mL de DMEM precalentado a 37 °C a la mezcla anterior durante un período de 90 s, seguido de otros 30 mL de DMEM fresco. Coloque el tubo de fusión en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
11. Después de la incubación en el baño tibio, recoja las células y vuelva a suspenderlas en medio HAT. A continuación, se cultiva en una placa de 96 pocillos inoculada con macrófagos peritoneales.
12. Cinco días después, agregue 100 μL de medio HAT fresco a cada pocillo e incube la placa durante 5 días adicionales, después de lo cual reemplace el medio con medio HT (DMEM suplementado con 10% de FBS y 1x suplemento de HT).
13. Utilice una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/mL de proteína APN diluida en 0,05 M de PBS (pH 9,6) para analizar los anticuerpos monoclonales en el sobrenadante del hibridoma mediante el ensayo ELISA.
    1. Cuando se observan grupos de células en el medio en los pocillos de la placa de 96 pocillos (debido al crecimiento celular y la liberación de metabolitos, el pH en el medio disminuye a 6.8 y el rojo fenol cambia de fucsia a amarillo) o grupos de células, adquiera 100 μL de sobrenadante de los pocillos seleccionados y agréguelos a los pocillos de la placa ELISA recubierta. Utilice un lector de microplacas para medir los valores de OD₄₅₀.
    2. Utilice los anticuerpos policlonales contra APN y suero de ratón no infectado como control positivo y negativo, respectivamente, y utilice PBS como control en blanco. En este estudio, se reconoció como estándar de selección positivo la relación OD₄₅₀ de muestra a control negativo (P/N) ≥ 2.1.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Completa el adyuvante de Freund	Sigma-Aldrich	F5881	Inmunización animal
DMEM	Gibco	11965092	cultivo celular
DMEM-F12	Gibco	12634010	cultivo celular
Kit de conteo de células mejorado-8	Beyotime Biotecnología	C0042	Medición de la viabilidad y vitalidad celular
Suero fetal bovino	Gibco	10091	cultivo celular
Antibiótico selectivo Geneticin™	Gibco	11811098	Antibiótico selectivo
Suplemento HAT (50X)	Gibco	21060017	Selección de células
Suplemento HT (100X)	Gibco	11067030	Selección de células
Adyuvante de Freund incompleto	Sigma-Aldrich	F5506	Inmunización animal
Lector de microplacas	BioTek	CAJA 998	Análisis ELISA
Polietilenglicol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Fusión celular
Microplaca de 96 pocillos	Corning	3599	cultivo celular