Un método para producir anticuerpos recombinantes contra la metalopéptidasa

Resumen

Fuente: Xia, P. et al., Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina.J. Vis. Exp.(2021)

Este video muestra un procedimiento para la producción de anticuerpos recombinantes contra la metaloproptisasa. Los plásmidos recombinantes portadores de genes para el anticuerpo, la proteína fluorescente verde y la resistencia a los antibióticos se transfectan a las células epiteliales con lipofectamina. Las células transfectadas se seleccionan y cultivan para generar anticuerpos recombinantes.

Protocolo

>1. Preparación del antígeno de la proteína aminopeptidasa N (APN) porcina

NOTA: La cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) y las células de APN expresadas de manera estable pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 se construyeron en un estudio previo.

1. Recupere las bacterias de una reserva de glicerol congelada y colóquelas en placas de Luria-Bertani (LB) que contengan 50 μg/mL de kanamicina (Km⁺) para el aislamiento de una sola colonia.
2. Seleccionar una sola colonia de la placa recién veteada, cultivar en 4 mL de medio LB (10 g/L de triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levad....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Completa el adyuvante de Freund	Sigma-Aldrich	F5881	Inmunización animal
DAPI	Beyotime Biotecnología	C1002	Contratinción nuclear
DMEM	Gibco	11965092	cultivo celular
DMEM-F12	Gibco	12634010	cultivo celular
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado Dylight 549	Abbkine	A23310	Análisis de inmunofluorescencia indirecta
Kit de conteo de células mejorado-8	Beyotime Biotecnología	C0042	Medición de la viabilidad y vitalidad celular
Suero fetal bovino	Gibco	10091	cultivo celular
Antibiótico selectivo Geneticin™	Gibco	11811098	Antibiótico selectivo
Suplemento HAT (50X)	Gibco	21060017	Selección de células
Suplemento HT (100X)	Gibco	11067030	Selección de células
Adyuvante de Freund incompleto	Sigma-Aldrich	F5506	Inmunización animal
Isopropilo β-d-1-tiogalactopiranósido	Sigma-Aldrich	I5502	Expresión de proteínas
kanamicina	Beyotime Biotecnología	ST102	Antibiótico bactericida
Microscopio confocal Leica TCS SP8 STED	Microsistemas Leica	SP8 STED	Imágenes de fluorescencia
Reactivo Lipofectamine® 2000	Termopescador	11668019	transfección
Clasificación de células activadas por fluorescencia LSRFortessa™	Bd	FACS LSRFortessa	Citometría de flujo
Lector de microplacas	BioTek	CAJA 998	Análisis ELISA
Micro espectrofotómetro	Termo Fisher	Nano Drop uno	Detección de la concentración de ácidos nucleicos
NaCl	Reactivo químico Sinopharm	10019308	Caldo de cultivo
(NH4)2SO4	Reactivo químico Sinopharm	10002917	Caldo de cultivo
Opti-MEM	Gibco	31985088	cultivo celular
Polietilenglicol 1500	Roche Diagnostics	10783641001	Fusión celular
Kit de síntesis de ADNc de 1ª hebra de PrimeScript™	Biografía de Takara	RR047	qPCR
Proteína A agarosa	Beyotime Biotecnología	Pág. 2006	Purificación de proteínas de anticuerpos
Protino® Ni+-TED 2000 Columnas Empaquetadas	MACHEREY-NAGEL	745120.5	Purificación de proteínas
Sistema de clonotipado SBA-HRP	Biotecnología del Sur	Mayo-00	Isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón
Kit de clonación sin fisuras	Beyotime Biotecnología	D7010S	Construcción de plásmidos
Matraces de agitación	Beyotime Biotecnología	E3285	cultivo celular
Carbonato de sodio-tampón de bicarbonato de sodio	Beyotime Biotecnología	C0221A	cultivo celular
Célula de transferencia semiseca Trans-Blot SD	Bio-rad	170-3940	Western blot
Triptona	Oxoide	LP0042	Caldo de cultivo
Homogeneizador ultrasónico	Biotecnología de Ningbo Xinzhi	JY92-IIN	Homogeneización de muestras
Extracto de levadura	Oxoide	LP0021	Caldo de cultivo
Microplaca de 96 pocillos	Corning	3599	cultivo celular