>1. Preparación del antígeno de la proteína aminopeptidasa N (APN) porcina
NOTA: La cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) y las células de APN expresadas de manera estable pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 se construyeron en un estudio previo.
- Recupere las bacterias de una reserva de glicerol congelada y colóquelas en placas de Luria-Bertani (LB) que contengan 50 μg/mL de kanamicina (Km+) para el aislamiento de una sola colonia.
- Seleccionar una sola colonia de la placa recién veteada, cultivar en 4 mL de medio LB (10 g/L de triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura, pH 7,2) suplementado con Km+ (50 μg/mL), y dejar crecer durante la noche (12-16 h) con agitación (178 rpm) a 37 °C.
- Diluir las bacterias preparadas a 1:100 en caldo fresco Km+ LB e incubar a 37 °C agitando durante 2-3 h hasta que el OD600 alcance 0,4-0,6.
- Añadir isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al medio hasta una concentración final de 0,4 mM, e incubar los cultivos durante 10 h adicionales a 16 °C.
- En consecuencia, centrifugar y recolectar las bacterias mediante inducción IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).
- Vuelva a suspender el pellet celular con 5 mL de tampón LEW (Lisis/Equilibrio/Lavado) (50 mM de fosfato de sodio anhidro monobásico (NaH2PO4) y 300 mM de NaCl, pH 8,0) que contenga 1 mg/mL de lisozima. Agitar la suspensión bacteriana durante 30 minutos sobre hielo y sonicar completamente (15 s de pulso y 20 s de apagado, 15 min) utilizando un homogeneizador ultrasónico.
- Centrifugar el lisado de células crudas a 4 °C y 10.000 × g durante 30 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a una columna preequilibrada e incube 1-2 minutos antes del drenaje por gravedad. Repita este paso tres veces.
- Lave la columna con 20 ml de tampón LEW y drene por gravedad. Eluir la proteína APN marcada con histidina utilizando 9 mL de tampón de elución (50 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl y 250 mM de imidazol, pH 8,0) y recogerla en el tubo de diálisis.
- Diálisar la solución proteica durante la noche a 4 °C en tampón carbonato de sodio-bicarbonato de sodio (solución salina tamponada con fosfato (PBS), 135 mM de NaCl, 4,7 mM de cloruro de potasio, 2 mM de NaH2PO4 y 10 mM de fosfato de sodio dodecahidratado dibásico, pH 7,2).
- Analice utilizando un gel SDS-PAGE al 12,0% y Western blot para evaluar la pureza de la proteína APN.
- Cargue 5 μg de proteína en cada pocillo del gel y deje funcionar a 110 V durante 1,5 h. A continuación, transfiera la proteína a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) durante 50 min a 15 V. Determine la concentración de la proteína purificada mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
>2. Inmunización animal
- Por vía subcutánea (s.c.) inyecte a ratones hembra BALB/c, de 6 a 8 semanas de edad, 50 μg de proteína APN o PBS (control negativo) mezclado con adyuvantes una vez cada 2 semanas. Use el adyuvante completo de Freund que contiene las micobacterias muertas por calor para la inmunización inicial, y el adyuvante incompleto de Freund para las inmunizaciones de refuerzo. Mezcle volúmenes iguales de proteína APN (o PBS) y adyuvante de Freund o adyuvante de Freund incompleto, respectivamente.
- Detección de títulos de anticuerpos contra APN en los sueros de estos ratones mediante un ensayo indirecto de inmunoabsorción enzimática (ELISA) utilizando una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/mL de proteína APN diluida en 0,05 M PBS (pH 9,6).
3. Tecnología de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales contra APN
- Por vía intraperitoneal (i.p.) inyectar 100 μg de proteína APN en los ratones seleccionados para un refuerzo final del antígeno.
- Tres días después, se sacrificó a los ratones con pentobarbital sódico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) y luxación cervical.
- Recoja los bazos y lávese con el medio Eagle Modified Eagle (DMEM) de Dulbecco dos veces para eliminar las células sanguíneas y grasas. Filtre la suspensión de células del bazo utilizando una rejilla de cobre de malla 200 para eliminar los restos de tejido, y recoja las células del bazo mediante centrifugación (1500 × g, 10 min) para eliminar la membrana del bazo.
- Células de mieloma de ratón SP2/0 en un matraz de 25cm2 que contiene 5 mL de DMEM suplementado con un 6% de suero fetal bovino (FBS) y cultivo a 37 °C, 6% de atmósfera de dióxido de carbono (CO2) para mantener la viabilidad celular. Después de 5-6 días de cultivo, las células alcanzan un 80%-90% de confluencia después de la reanimación y se encuentran en la fase de registro de crecimiento. Bajo el microscopio, las células son redondas, brillantes y claras.
- Un día antes de la hibridación, recoja macrófagos de las cavidades peritoneales de los ratones de acuerdo con un método publicado anteriormente.
- Siembre macrófagos peritoneales a una densidad de 0,1-0,2 × 105/mL en placas de 96 pocillos, cada pocillo conteniendo 100 μL de medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (DMEM suplementado con 10% de FBS y 1x suplemento de HAT), e incube a 37 °C, 6 % de CO2 en atmósfera humidificada durante la noche.
- Para la hibridación, aspire suavemente las células SP2/0 con una pipeta de 8 a 10 frascos y suspenda en 10 ml de medio DMEM sin suero. Lave las células con DMEM nuevo, centrifugue (1500 × g, 10 min) dos veces y luego vuelva a suspender en 10 mL de DMEM.
- Mezcle las células del bazo cuantificadas con las células SP2/0 en una proporción de 10:1 y transfiéralas a tubos de 50 mL. Centrifugar (1500 × g, 10 min) y desechar el sobrenadante. Recoja los gránulos de celda en la parte inferior de los tubos y golpee con la palma de la mano para aflojar los gránulos antes de la hibridación.
- Añadir 1 mL de polietilenglicol 1500 (PEG 1500), precalentado a 37 °C, gota a gota con un gotero al pellet de celda aflojado durante un período de tiempo de 45 s mientras se gira suavemente el fondo del tubo.
- Añada lentamente 1 mL de DMEM precalentado a 37 °C a la mezcla anterior durante un período de 90 s, seguido de otros 30 mL de DMEM fresco. Coloque el tubo de fusión en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.
- Después de la incubación en el baño tibio, recoja las células y vuelva a suspenderlas en medio HAT. A continuación, se cultiva en una placa de 96 pocillos inoculada con macrófagos peritoneales.
- Cinco días después, agregue 100 μL de medio HAT fresco a cada pocillo e incube la placa durante 5 días adicionales, después de lo cual reemplace el medio con medio HT (DMEM suplementado con 10% de FBS y 1x suplemento de HT).
- Utilice una placa de microtitulación recubierta con 5 μg/mL de proteína APN diluida en 0,05 M de PBS (pH 9,6) para analizar los anticuerpos monoclonales en el sobrenadante del hibridoma mediante el ensayo ELISA.
- Cuando se observan grupos de células en el medio en los pocillos de la placa de 96 pocillos (debido al crecimiento celular y la liberación de metabolitos, el pH en el medio disminuye a 6.8 y el rojo fenol cambia de fucsia a amarillo) o grupos de células, adquiera 100 μL de sobrenadante de los pocillos seleccionados y agréguelos a los pocillos de la placa ELISA recubierta. Utilice un lector de microplacas para medir los valores de densidad óptica 450 (OD450).
- Utilice los anticuerpos policlonales contra APN y suero de ratón no infectado como control positivo y negativo, respectivamente, y utilice PBS como control en blanco. En este estudio, se reconoció como estándar de selección positivo la relación OD450 de muestra a control negativo (P/N) ≥ 2.1.
- Después de tres rondas consecutivas de selección positiva, seleccione el hibridoma que muestre una mayor respuesta serológica frente a la proteína APN para un ensayo de dilución limitado.
- Prepare los macrófagos peritoneales y la semilla en placas de 96 pocillos como se describió anteriormente.
- Suspender las células de hibridoma en medio HT a un promedio de 0,5-2 células por pocillo y cultivar en una incubadora a 37 °C, 6% de CO2. Repita este paso tres o cuatro veces hasta que la tasa de positividad indicada por el inmunoensayo ELISA alcance el 100%.
- Bajo la presión de la congelación y descongelación continuas, seleccione las células de hibridoma positivas capaces de secretar de forma estable anticuerpos anti-APN y proliferar normalmente.
- Administrar una única inyección i.p. de 0,3 mL de pristane a cada ratón (8-10 semanas). A los 10 días después de recibir prístino, inyecte a cada ratón 2-5 x 105 células de hibridoma en 0,5 mL de PBS (pH 7,2).
- Recoja cuidadosamente el líquido peritoneal de la cavidad peritoneal de estos ratones de 8 a 10 días después de la inyección.
- Recolectar los sobrenadantes por centrifugación a 5.000 × g durante 15 min y purificar los anticuerpos en los sobrenadantes utilizando una precipitación de sulfato de amonio saturado al 33% [(NH4)2SO4] y agarosa de proteína A.
>4. Caracterización de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra la proteína APN
- Determine el subtipo de inmunoglobulina de los mAbs recolectados utilizando un sistema de clontipificación SBA-HRP. Utilice SDS-PAGE y Western blot para evaluar la pureza y especificidad de los anticuerpos monoclonales.
- Analice la especificidad del epítopo de mAb frente a la proteína APN mediante ELISA. El valor de aditividad (AV) es la relación entrelos mAbs OD (a+b) y (ODmAbs-a+ODmAbs-b), que se utiliza para evaluar si los mAbs reconocen el mismo sitio antigénico; ODmAbs-a y ODmAbs-b representan los valores de OD450 de diferentes anticuerpos monoclonales contra APN solos, y ODmAbs (a+b) representan los valores de OD450 de una mezcla 1:1 de dos mAbs contra APN.
- Evalúe cada muestra al menos cuatro réplicas y repita todo el experimento al menos tres veces.
>5. Expresión de rAbs contra APN
- Extraiga el ARN total de las células de hibridoma y el bazo mencionados anteriormente de ratones inmunizados con APN (por ejemplo, TRIzol). Sintetice ADN complementario (ADNc) utilizando un kit de síntesis de ADNc según las instrucciones del fabricante.
- Amplifique las regiones variables de los mAbs mediante la reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR) y determine las secuencias de cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) mediante secuenciación. Analice los genes que codifican VH y VL utilizando la herramienta de análisis del genoma del ratón IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Combine los genes VH y VL con secuencias líderes y subclónelos secuencialmente en los vectores pET28a (+) y pIRES2-ZsGreen1, respectivamente, utilizando la tecnología de clonación sin interrupciones para permitir la inserción de fragmentos de ADN sin cicatrices. Los cebadores específicos se enumeran en la Tabla 1.
- Cultive las bacterias transformadas en pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 en presencia de 0,4 mM de IPTG en agitadores orbitales a 37 °C durante 10 h. A continuación, induzca, purifique y evalúe la expresión de la proteína rAbs mediante la purificación rutinaria de proteínas.
- Siembre 100 μL 0,5 x 105 células CHO por pocillo en una placa de 96 pocillos e incube a 37 °C en una atmósfera de 6% de CO2 durante 18-24 h. Cuando las células alcancen el 80-90% de confluencia, diluir el plásmido pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN con Opti-MEM hasta una concentración final de 0,1 μg/μL, e incubar 5 min a temperatura ambiente antes de usarlo para la transfección.
- Mezcle suavemente 50 μL de plásmido pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN diluido con 1 μL de Lipofectamine 2000 y 49 μL de Opti-MEM e incube la mezcla durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Añadir 100 μL de mezcla a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga células CHO e incubar a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 6% durante 4-6 h.
- A las 4-6 h después de la transfección, reemplace el medio con medio DMEM-F12 suplementado con 10% de FBS e incube la placa durante otras 48 h. A continuación, añada 400 μg/mL de G418 a cada pocillo para seleccionar las células transfectadas de forma estable.
- Después de 10 días de selección utilizando medio DMEM-F12 suplementado con 10% de FBS y 400 μg/mL de G418, clasifique las células (3,0 × 107 células/mL) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. Aproximadamente el 10-15% de la población celular fue positiva.
- Células positivas recolectadas diluidas en serie, siembra a un promedio de 0,5-2 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y cultivo en una incubadora a 37 °C, 6% de CO2. Mantener las células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectadas de forma estable mediante selección con G418 (200 μg/mL).
- La concentración de FBS en el medio de cultivo celular descrito anteriormente disminuye gradualmente del 10% al 0% durante la fase de crecimiento logarítmico durante un período de tiempo de 3 semanas. A continuación, adapte las células CHO adheridas al crecimiento en suspensión en un medio libre de suero.
- Cultive las células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO sembradas en la fase de crecimiento logarítmico en medio libre de suero a una densidad de 0,8-1,0 × 105 células/mL en matraces de agitación a 80-110 rpm a velocidad de agitación y 37°C, 6% CO2.
- Recoja la suspensión celular cada 12 h para determinar los cambios en la viabilidad y vitalidad celular utilizando un kit de conteo celular (por ejemplo, CCK-8) según las instrucciones del fabricante.
- La expresión de anticuerpos alcanza niveles máximos cuando la viabilidad celular disminuye al 80% y la densidad celular alcanza 1,0-2,0 × 106 células/mL. Recoja los sobrenadantes celulares mediante centrifugación, filtre con un filtro de membrana de politetrafluoroetileno de 0,22 μm y purifique con agarosa de proteína A.
- Confirmar la producción de anticuerpos específicos de APN mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA).
- Determine los títulos de anticuerpos y las afinidades de unión mediante el ensayo ELISA como se describió anteriormente. Calcule la constante de disociación de equilibrio (valor KD) de los anticuerpos con una ecuación logística de cuatro parámetros utilizando software.
Tabla 1. Los cebadores específicos utilizados en este estudio.
| cebador | Secuencia (5'-3') |
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG |
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT |
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC |
| pIRES2-ZsGreen1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC |
