>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Aislamiento de PBMCs y enriquecimiento/purificación de células NK
NOTA: También se pueden realizar otros métodos para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y el enriquecimiento/purificación.
- Extraiga 200 mL de sangre en condiciones reguladas en un tubo que contenga heparina.
- Agregue 15 mL del medio de gradiente de densidad en un tubo de 50 mL con una barrera porosa incorporada. Girar el tubo a 1000 x g durante 30 s.
- Agregue 12,5 mL de sangre en el tubo, seguido de otros 12,5 mL de PBS, e invierta suavemente 3 veces. Gire el tubo a 800 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) sin interrupciones.
- Prepare un tubo cónico de 50 mL con 40 mL de PBS para cada tubo con una barrera porosa mientras las células están girando.
- Retire con cuidado los tubos e inspeccione después de la centrifugación. Compruebe si hay una capa delgada y visiblemente blanca de PBMC por encima de la barrera porosa, entre las demarcaciones de 20 mL y 25 mL en el tubo de 50 mL.
- Retire con cuidado la mayor cantidad de líquido posible de la parte superior con una pipeta sin alterar la capa delgada y blanca de PBMC.
- Con una pipeta serológica limpia de 10 ml, retire suavemente la capa de PBMC además de la capa líquida clara y amarillenta hasta el filtro del tubo.
- Expulse las PBMC y el líquido en el cónico de 50 mL que contiene PBS preparado en el paso 1.4. Girar los tubos a RT y 300 x g durante 5 min.
- Aspire el lavado de PBS y agregue 40 ml adicionales de PBS. Girar los tubos a RT y 300 x g durante 5 min.
- Después del lavado, cuente las células y vuelva a suspenderlas en 40 μL de BSA/PBS al 2% por 1 x 107 células.
- Proceda al aislamiento de las células NK utilizando el método de elección. Las opciones incluyen clasificación manual o automatizada basada en perlas magnéticas. También se puede realizar una clasificación celular activada por fluorescencia.
- Extraiga una pequeña alícuota de células para determinar la pureza de las células NK mediante citometría de flujo. La estrategia de compuerta incluye lo siguiente: compuerta en células vivas en función del perfil de dispersión frontal frente a lateral, y luego evaluar la pureza en función de los marcadores NK (por ejemplo, CD3, CD56) en la población viva específica. La pureza típica es del >95%.
- Una vez completado el aislamiento, haga girar las células a RT y 300 x g durante 5 min para pellets y aspirar.
- Vuelva a suspender el pellet de celda a 1 x 107 células/mL en RPMI 1640 con nutrientes, 10% de FBS inactivado por calor, 1 mM de piruvato de sodio, 55 mM 2-ME y 10 mM HEPES (pH = 7,2).
>2. Activación mediada por anticuerpos de células NK a través de FcγRIIIa
- Ajuste una microcentrífuga refrigerada a 4 °C.
- Dispensar 1 x 106 (100 μL de) células NK resuspendidas en tubo(s) de 1,5 mL y colocarlas en hielo.
nota: Las células se pueden dispensar en una placa de fondo en U de 96 pocillos si hay numerosas muestras.
- Prepare 1 μL de 100 μg/mL de rituximab (o anticuerpo de interés) por muestra y agregue 1 μL a las células para obtener una concentración final de 1 μg/mL de anticuerpos.
nota: Se pueden agregar otras moléculas a las células en este punto o antes para la evaluación de los efectos de combinación. En este caso, se utilizó ritixumab para la estimulación. En estudios anteriores, se han añadido inhibidores de moléculas pequeñas a los estímulos.
- Incubar la muestra en hielo durante 30 min. Durante la incubación, prepare 50 μl de 50 μg/mL de anticuerpo de cadena ligera κ humano por muestra en un medio y caliéntelo a 37 °C en un bloque de calor o en un baño de agua.
- Después de la incubación de las células en hielo, añadir 1 mL de medio helado y centrifugar a 135 x g durante 5 min a 4 °C. Lavar de nuevo con 1 mL de medio helado.
- Aspirar el sobrenadante después del último lavado y añadir 50 μL de la mezcla de cadena ligera κ antihumana preparada en el paso 2.4.
- Incube inmediatamente las muestras para los puntos de tiempo determinados por el usuario final a 37 °C en un bloque de calor o en un baño de agua.
- Detenga la estimulación añadiendo 1 mL de medio helado e inmediatamente centrifuga las muestras en una centrífuga refrigerada a 135 x g durante 5 min. Lavar una vez más con 1 mL de medio helado.
