Una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno

Resumen

Fuente: Devilder, M., et al. Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativos a partir de células B raras específicas de antígenos que circulan en la sangre. J. Vis. Exp. (2018).

El video muestra una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno. Los vectores de expresión eucariotas que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, clonados a partir de células B aisladas específicas de antígeno, se introducen en células de mamíferos utilizando poliplexos. Una vez dentro de las células, estos vectores se traducen y los péptidos de cadena pesada y ligera resultantes se ensamblan en anticuerpos, que posteriormente son secretados por las células.

Protocolo

1. Producción de mAbs

1. El día antes de la transfección, sembró 15.000 células embrionarias de riñón humano 293A (HEK 293A) en 200 μL del medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS por pocillo en placas de 96 pocillos. Incubar durante la noche en una incubadora de CO₂ (5% de CO₂) a 37 °C.
2. Cotransfect 293A células en medio DMEM que contienen un 10% de FBS utilizando un derivado lineal de polietilenimina como reactivo de transfección.
   nota: Realizar la transfección por triplicado. El siguiente protocolo es para un pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos.
   1. Diluir 0,5 μL de reactivo de transfección de ADN en 10 μL de 150 mM de NaCl. Diluir 0,125 μg de cadena pesada variable (vH) y 0,125 μg de cadena ligera variable (vL) que expresan vectores en 10 μL de NaCl de 150 mM. Vértice cada dilución durante 10 s.
   2. Añadir 10 μL de reactivo de transfección de ADN diluido en la solución de 10 μL de ADN. Vortex 15 s e incubar durante 15 min a temperatura ambiente. Agregue la mezcla de 20 μL gota a gota en las celdas 293A y mezcle girando suavemente la placa.
3. Reemplace el medio 16 h después de la transfección y el cultivo de las células durante 5 días en medio libre de suero.
   nota: Utilice un medio libre de suero para evitar que las inmunoglobulinas séricas (Igs) contaminen los anticuerpos producidos.
4. Eliminar células y residuos por centrifugación a 460 x g durante 5 min.
5. Coseche los sobrenadantes por aspiración con una pipeta multicanal y transfiéralos a una placa de 96 pocillos con fondo en V.
6. Recubrimiento de Ag relevante durante la noche a 4 °C en 100 μL por pocillo de tampón de recubrimiento reconstituido de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)/punto de inmunoadsorción enzimática (ELISPOT) 1x a una concentración final de 2 μg/mL en placas ELISA de 96 pocillos.
7. Bloquee los pozos con medio FBS DMEM al 10% durante 2 h a 37 °C.
8. Añadir 50 μL de sobrenadantes de células 293A transfectadas del paso 1.5 e incubar durante 2 h en RT.
9. Añadir 100 μL de un anticuerpo anti-inmunoglobulina G humana (IgG Ab) conjugado con la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP) a 1 μg/mL e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Añadir 50 μL de sustrato cromogénico (3,3',5,5' tetrametilbencidina, TMB) e incubar durante 20 min.
10. Leer densidades ópticas a 450 nm en un espectrofotómetro.
    nota: Los mAbs específicos revelados por el ensayo ELISA pueden producirse a gran escala y purificarse en la columna de proteína A que presenta afinidad por la IgG humana.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular HEK 293A	Thermo Fisher científico	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medio	Gibco por life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-glucosa 0,11g/L Piruvato de Sodio (-) L-Glutmina
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
Suero fetal bovino (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Reactivo de transfección de ADN Jet PEI	PolyPlus	Págs. 101-40
Fondo planoPlaca de 96 pocillos	halcón	353072
Placa de 96 pocillos con fondo en V	Nunc/Thermofisher	55142