Entrega de anticuerpos mejorada por convección en el cerebro de un ratón

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de los catéteres escalonados

1. Preparación de un tubo de sílice fundida para el paso del catéter
   1. Corte el capilar de sílice fundida con un diámetro interior de 0,1 mm y un espesor de pared de 0,0325 mm en el tubo a una longitud de 30 mm.
   2. Examine el tubo en busca de grietas y pula los extremos con una microforja para asegurarse de que las aberturas del tubo tengan una superficie lisa.
2. Fijación de la cámara de aire en una aguja metálica
   1. Monte una aguja de 27 G en una jeringa de 10 μL y coloque la jeringa en un robot estereotáctico.
   2. Con el robot, mueva la jeringa sobre una superficie dura y tóquela con la punta de la aguja. Esta posición debe anotarse o guardarse en el software porque servirá como superficie de referencia para establecer la longitud del escalón del catéter.
   3. Eleve la aguja para permitir que el capilar de sílice fundida se coloque dentro de la aguja.
   4. Coloque el capilar de sílice fundida en la aguja de modo que sobresalgan 20 mm del capilar de la aguja.
   5. Con una pipeta, distribuya uniformemente 2 μL de adhesivo de cianoacrilato de alta viscosidad sobre el capilar, comenzando desde la aguja metálica y terminando 10 mm por encima del extremo inferior del capilar, como se muestra en la Figura 1.
   6. Con el robot estereotáctico, baje la aguja hasta que la punta de la aguja metálica esté 1 mm por encima de la superficie de referencia. De esta manera, el capilar de sílice fundida se fijará en la aguja metálica, formando un escalón de 1 mm desde la punta. Retire cualquier exceso de pegamento que se forme en el extremo de la aguja de metal para evitar desafilar el escalón.
   7. Espere 15 minutos para que el pegamento se endurezca y retire la jeringa con el catéter del robot estereotáctico. Confirme que todo el exceso de pegamento se ha eliminado en el paso revisando la punta del catéter bajo un microscopio.
3. Prueba del catéter escalonado con un bloque de agarosa
   1. Prepare una solución de agarosa al 0,6% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una bandeja de gel convencional y espere hasta que polimerice. Corta la agarosa en bloques de aproximadamente 20 mm x 20 mm. Hasta su uso, mantenga los bloques sumergidos en PBS.
   2. Llene manualmente la jeringa del catéter escalonado con 10 μL de solución al 0,4% de azul de tripán filtrado.
   3. Con el robot estereotáctico, dispense 1 μL a 0,2 μL/min para evaluar el sellado del escalón del catéter durante el procedimiento de fijación. La solución de azul de tripano debe ser visible únicamente en la punta del catéter. Límpialo con un pañuelo de papel.
   4. Coloque el bloque de agarosa en el robot estereotáctico y calibre el robot de modo que la punta del catéter quede referenciada contra la superficie del bloque de agarosa.
   5. Programe los parámetros de inyección para CED.
      1. Para el volumen de inyección de 5 μL, utilice los siguientes pasos: 1 μL a 0,2 μL/min, luego 2 μL a 0,5 μL/min y 2 μL a 0,8 μL/min. Ajuste el volumen final de inyección de acuerdo con el plan experimental específico cambiando proporcionalmente la duración de cada uno de los pasos.
      2. Para inyectar la solución en el putamen caudado murino (cuerpo estriado), realice dicha inyección en una posición de 1 mm frontal y de 1,5 a 2 mm lateral del bregma a una profundidad de 3,5 mm.
      3. Después de la inyección, deje el catéter en su lugar durante 2 minutos y luego retraiga a 1 mm/min para asegurar una dispersión adecuada del líquido en el cerebro y sellar el tracto de inyección durante la extracción >nota: Todos los parámetros se pueden programar en un solo script dependiendo del robot estereotáctico específico.
   6. Inicie el procedimiento CED e inyecte 5 μL de solución de azul de tripano en el bloque de agarosa.
   7. Evalúe la forma de una nube de azul tripán en la agarosa y las posibles fugas a lo largo del tracto del catéter. El azul de tripán debe formar un elipsoide o una nube redonda con el centro alrededor de la punta del catéter y un diámetro de al menos 1 mm. No debe ser visible un reflujo importante sobre la punta de la aguja de metal.
   8. Colocar un nuevo bloque de agarosa e iniciar una segunda inyección de 1 μL a 0,2 μL/min para evaluar la obstrucción del catéter con la agarosa. El azul de tripán debe comenzar a formar una nube desde la punta del catéter inmediatamente después del inicio de la inyección.
   9. Evaluar si el volumen sobrante en la jeringa corresponde a 3 μL. Cualquier variación puede indicar una fuga de líquido a través del montaje del catéter o del émbolo de la jeringa.
   10. Si todas las inyecciones de prueba son exitosas, el catéter está bien sellado y recto, y no se observa solución de azul de tripano desde otros puntos que no sean la punta del catéter, lave el catéter con H₂O desionizado (dH₂O) hasta que no se vean rastros de azul de tripán y luego lave diez veces de la siguiente manera: 70% de etanol y 100% de etanol seguido de un lavado nuevamente con 70% de etanol y agua desionizada limpia.
   11. Guarde el catéter en condiciones secas.

>2. Entrega de solución de anticuerpos mejorada por convección en el cerebro murino

NOTA: Dependiendo de las regulaciones locales de bienestar animal, se pueden implementar varios tipos de anestésicos, analgésicos y antibióticos para este procedimiento. Este protocolo describe el uso de la anestesia inyectable. Los anestésicos inhalatorios como el isoflurano también se pueden utilizar montando una máscara nasal en el marco estereotáctico. Además, recomendamos añadir antibióticos al agua potable para la profilaxis de infecciones.

1. Configuración quirúrgica
   1. Prepare soluciones anestésicas y antídotas. Los ratones se pueden anestesiar de forma segura utilizando un anestésico de tres componentes que contiene fentanilo (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) y medetomidina (0,5 mg/kg) diluidos en agua destilada estéril (dH₂O). Realizamos un procedimiento de despertar en dos etapas utilizando dos soluciones de antídoto, una que contiene flumazenil (0,5 mg/kg) y buprenorfina (0,1 mg/kg) en dH₂O estéril (primera solución de antídoto). El segundo tiene atipamezol (2,5 mg/kg) en dH₂O estéril (segunda solución antídoto).
   2. Preparar una solución de analgesia que contenga carprofeno (5,667 mg/kg) diluido con dH₂O estéril.
   3. Limpie el marco estereotáctico, la almohadilla térmica y los elementos del robot estereotáctico. Tenga en cuenta que no todas las piezas del robot se pueden limpiar sin riesgo de daños. Consulte el manual del robot para obtener detalles sobre la limpieza y la preparación para su uso.
   4. Ensamble la jeringa con el catéter escalonado y enjuague varias veces con dH₂O, 70% de etanol y 100% de etanol, seguido de un lavado nuevamente con 70% de etanol y dH₂O. Finalmente, enjuague la jeringa con PBS u otros tampones para preparar la solución para la inyección intracraneal, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo artificial. El émbolo de la jeringa debe moverse suave y libremente durante el procedimiento.
   5. Calibrar el software del robot estereotáctico con el marco estereotáctico.
   6. Pruebe el software del robot estereotáctico asegurándose de que los brazos del robot se muevan libremente, que la bomba de inyección esté conectada correctamente y que pueda realizar el procedimiento CED sin ninguna perturbación. Esto incluye probar el movimiento del robot, la inyección en rampa, verificar el paso de espera de 2 minutos y verificar la velocidad de retracción del catéter. Todos los parámetros deben ajustarse al procedimiento CED preprogramado descrito en el punto 1.3.5.
   7. Inserte la broca en el taladro. Se recomienda esterilizar las brocas antes de usarlas.
   8. Prepare la solución de anticuerpos utilizando PBS u otras soluciones tampón, como el líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF). Se pueden inyectar de 1 a 20 μg de anticuerpo en 5 μL en un solo procedimiento CED. Se deben analizar otros volúmenes y cantidades de proteínas antes de realizar el experimento. Tenga en cuenta que el uso de soluciones de alta viscosidad puede provocar la obstrucción del catéter.
   9. Cargue manualmente la jeringa con el anticuerpo diluido.
2. Inyección de anticuerpos por CED en el cuerpo estriado
   1. Pesar el ratón e inyectar la solución anestésica de tres componentes en el peritoneo de acuerdo con el peso corporal. Tenga en cuenta el tiempo de inyección. Transfiera el mouse a una jaula separada calentada con una almohadilla térmica.
   2. Observe el ratón para determinar cuándo comienza la sedación. Cuando el ratón deje de moverse, aplique un ungüento oftálmico en los ojos para proteger la córnea de la sequedad durante la cirugía. La sedación completa suele comenzar entre 10 y 15 minutos después de la inyección de la solución anestésica de tres componentes.
   3. Compruebe las reacciones de dolor mediante la prueba de reflejo de pinzamiento para asegurar la anestesia completa del animal.
   4. Afeita la cabeza con una recortadora de pelo.
   5. Desinfecte la piel con bastoncillos de algodón empapados en solución de yodo. Frota la piel tres veces con movimientos circulares.
   6. Realice una incisión en la piel de 10 mm a lo largo de la línea media craneal, terminando a la altura de los ojos con un bisturí.
   7. Fije el mouse en el marco estereotáctico usando la pinza nasal y las barras de las orejas. Asegúrese de que la superficie del cráneo esté horizontal y bien asegurada. Además de una correcta navegación anatómica, también es crucial evitar inclinar el cráneo durante el ejercicio y el procedimiento CED.
   8. Coloque la jeringa en el robot estereotáctico.
   9. Sincronice la broca con la punta del catéter en un punto de referencia. La relación entre la posición del taladro y la jeringa debe determinarse con precisión en el software para que la inyección pueda realizarse en la región anatómica deseada del cerebro.
   10. Retraiga la piel con pinzas y localice el bregma en la superficie del cráneo.
   11. Haga referencia a Bregma en el software utilizando la punta de la broca.
   12. Mueva el taladro a una posición de 1 mm frontal y 2 mm lateral del bregma y taladre un orificio de rebaba. Tenga cuidado de no dañar la duramadre.
   13. Mueva la jeringa sobre el orificio de la rebaba.
   14. Dispense de 0,5 a 1 μl de la jeringa para asegurarse de que no queden burbujas de aire en el catéter.
   15. Inicie el programa CED descrito en el punto 1.3.5. Observe la superficie del cráneo en busca de rastros de reflujo de líquido desde el lugar de inyección. Controlar la frecuencia respiratoria del animal.
   16. Una vez finalizado el programa de CED y retirado el catéter del cerebro, ponga en marcha la bomba de inyección a 0,2 μL/min para comprobar si el catéter se ha obstruido durante la CED. Si no se produjo ninguna obstrucción, debería ver inmediatamente una gota de mezcla inyectable desde la punta del catéter.
   17. Antes de reutilizar o almacenar el catéter, examine visualmente el escalón del catéter bajo un microscopio para detectar cualquier signo de daño o desgaste y límpielo como en el paso 1.3.10.

Figura 1: Un dibujo esquemático que representa el área de aplicación del adhesivo. Los 10 mm superiores del tubo de sílice fundida se insertan en la aguja metálica. Aplique el pegamento en el tubo de 10 mm comenzando desde la punta de la aguja de metal.