1. Cultivo de células de microglía BV-2
NOTA: Manipule células BV-2 bajo contención de Bioseguridad Nivel 2. La línea celular BV-2 produce un retrovirus ecotrópico recombinante con envoltura (capaz de infectar solo células murinas); Estos virus son conocidos por su capacidad de transformación in vitro y su potencial tumorigénico in vivo.
- Cultivo de células BV-2 en medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina (en adelante medio de cultivo) mediante la siembra de células a 4 x 104 células/mL.
- Mantener los cultivos en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 °C.
NOTA: las células crecen sueltas y en suspensión.
>2. Etiquete agregados de Tau recombinantes con colorante fluorescente sensible al pH
NOTA: Los agregados de Tau se prepararon como se describe en Apetri et al.con la diferencia de que no se añadió tioflavina T (ThT) al tampón de reacción. Las muestras agregadas se recogieron en tubos centrífugos de 1,5 mL. La señal de fluorescencia final se comprobó mezclando 118 μL de la muestra del pool con 12 μL de una solución de 50 μM de ThT. Los agregados se separaron centrifugando la mezcla de reacción de agregación a 20.000 x g durante 1 h a 4 °C. El sobrenadante fue analizado por SEC-MALS para confirmar que toda la tau monomérica se convirtió en agregados. Los pellets (agregados de tau) se congelaron rápidamente y se almacenaron en un congelador a -80 °C.
- Vuelva a suspender los agregados de tau en un tampón de bicarbonato de sodio (NaHCO3) de 0,1 M a pH 8,5 a una concentración de 1 mg/mL (~ 20 μM).
nota: La concentración de agregados de tau se basa en la concentración inicial de monómeros evaluada por la absorción de monómeros de tau a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 0,31 mLmg-1 cm-1.
- Sonicar los agregados resuspendidos con un sonicador de sonda mientras los mantiene en hielo para evitar el sobrecalentamiento.
- Utilice una amplitud del 65% (con un sonicador de 250 W de potencia).
- Realice 8 pulsos de 3 s con pausas de 15 s entre pulsos para evitar el sobrecalentamiento.
- Prepare una solución madre de 8,9 mM de colorante sensible al pH (en adelante, colorante de pH) en dimetilsulfóxido (DMSO) siguiendo las instrucciones del fabricante><.
nota: Siempre prepare una solución fresca y úsela solo el día en que esté preparada.
- Agregue 10 moles de colorante por mol de proteína hasta una concentración final de colorante de 0.2 mM.
- Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Incubar la mezcla de reacción durante 45-60 min a temperatura ambiente, protegida de la luz.
- Mientras tanto, ensamble una columna de desalinización de gel de dextrano reticulado siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Equilibre la columna con 25 mL de tampón de NaHCO3 de 0,1 M pH 8,5 que contenga 3% de DMSO. Deseche el flujo a través.
- Agregue el producto de la reacción de etiquetado del agregado de tau a la columna en un volumen total de 2,5 mL. Si la muestra es inferior a 2,5 mL, agregue tampón hasta alcanzar un volumen total de 2,5 mL.
- Deje que la muestra ingrese completamente al gel empaquetado, deseche el flujo.
- Eluir con 3,5 mL de 0,1 M de tampón NaHCO3 pH 8,5 que contenga 3% de DMSO y recoger el eluido en 4 fracciones equivalentes en tubos de 2 mL.
- Determinar las concentraciones de proteínas de las 4 fracciones mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
- Almacene la proteína etiquetada en un congelador a -20 °C.
>3. Ensayo de captación con lectura de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
- Día 1 – Sembrar las células
- Lave las células BV-2 en el matraz retirando el medio de cultivo y añadiendo 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
nota: El volumen de lavado variará en función del tamaño del matraz de celdas utilizado. Por ejemplo, para un matraz T175, lavar con 10 mL de 1x PBS.
- Retirar el PBS del matraz y separar las células incubándolas con tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05% a 37 °C y 5% de CO2 hasta que las células se desprendan del matraz (aproximadamente 5 min).
nota: El volumen de tripsina-EDTA al 0,05% depende del tamaño del matraz de células utilizado. Por ejemplo, para un matraz T175, utilice 2 mL de tripsina-EDTA al 0,05%.
- Resuspenda las células en el medio de cultivo pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces.
NOTA: El volumen del medio de cultivo varía en función del tamaño del matraz utilizado y, por lo tanto, del número total de células en el matraz. Por ejemplo, para un matraz T175, utilice 8 mL de medio de cultivo.
- Cuente las células y cree una suspensión celular con una concentración final de 1 x 105 células/mL en un medio de cultivo que contenga 200 μg/mL de heparina.
- Placa: 250 μL de suspensión celular (2,5 x 104 células) por pocillo en una placa de fondo plano de cultivo de tejidos de 96 pocillos.
- Incubar la placa durante la noche a 37 °C y 5% de CO2.
- Día 1 – Preparar inmunocomplejos
- Descongele el tinte de pH tau en hielo.
- Prepare 65 μl por condición de una solución de 500 nM de agregados de colorante tau de pH en medio libre de suero (SFM) (DMEM de alta glucosa suplementado con 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 200 μg/mL de heparina).
- Preparar diluciones de anticuerpos en 65 μl de SFM a una concentración doble que la final. Mezcle el pH, el colorante, los agregados de tau y los anticuerpos en una placa inferior en U de 96 pocillos. El volumen final por condición es ahora de 130 μl, y la concentración de agregados de colorante tau de pH es de 250 nM. Sellar la placa de dilución e incubar durante la noche a 37 °C.
- Día 2 – Absorción de inmunocomplejos
- Retire el medio de cultivo de las células BV-2. Lave las celdas una vez con 100 μL de temperatura ambiente 1x PBS.
- Transfiera 125 μL de inmunocomplejos a las células mediante una pipeta multicanal. Incubar las células con los inmunocomplejos durante 2 h a 37 °C y 5% de CO2.
- Retire el medio de incubación de las celdas y deséchelo. Lave las celdas una vez con 100 μL de temperatura ambiente 1x PBS.
- Eliminar 1x PBS y tratar las células con 50 μL de tripsina-EDTA al 0,25% durante 20 minutos a 37 °C y 5% de CO2.
- Añadir 200 μL de medio de cultivo y resuspender bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo para separar las células. Transfiera las celdas a una placa inferior en U de 96 pocillos. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Coloque la placa en hielo, retire el medio de cultivo y lave las celdas dos veces resuspendiendo los gránulos de la celda en 150 μL de hielo frío 1x PBS. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Ponga las células en hielo, retire 1x PBS añadido y lávelas resuspendiendo los pellets de las células en 150 μL de tampón FACS frío (1x PBS, 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA), 2 mM de EDTA). Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Coloque las células en hielo, retire el tampón FACS añadido y vuelva a suspender las células en tampón FACS frío de 200 μL.
- Analice las muestras inmediatamente mediante FACS adquiriendo eventos 2 x 104 en la puerta de células vivas (consulte el paso 4.1).
