1. Purificación de anticuerpos
NOTA: El tampón de equilibrio para el anticuerpo interno es de 25 mM Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5. El tampón de elución utilizado es ácido acético 0,1 M. Los tampones y la resina (proteína A) dependen del anticuerpo específico purificado. El volumen de la columna es equivalente a la altura del lecho de resina. La cantidad de fase móvil utilizada se determina en términos de volumen de columna.
- Inicialización del sistema de purificación
- Abra el software adjunto al sistema de purificación. Siguiendo las instrucciones manuales, equilibre la columna con el tampón de equilibrio a un caudal de 2 mL/min durante 40 min. Detenga la ejecución manual después del equilibrio.
- En el colector de fracciones, coloque tubos cónicos de 15 mL para recoger el eluido de anticuerpos purificados y tubos cónicos de 50 mL para recoger el flujo durante el lavado con alto contenido de sal. Asegúrese de que el colector de fracciones se restablezca a la posición inicial abriendo y cerrando el colector de fracciones antes de comenzar la ejecución. El colector de fracciones se mantiene a 7 °C.
nota: El colector de fracciones se puede restablecer manualmente en la pestaña Colector de fracciones en Configuración, para tubos de 15 mL y 50 mL.
- Inyección de muestras
nota: El fluido de cultivo celular recolectado utilizado en los siguientes procedimientos se ha obtenido a partir de células de ovario de hámster chino cultivadas en microbiorreactores automatizados.
- Agregue el líquido de cultivo celular filtrado de 0,22 μm a una jeringa vacía de 12 ml cuyo extremo de la boquilla esté tapado.
- Sosteniendo la jeringa con la boquilla hacia abajo, inserte el émbolo de la jeringa hasta que una pequeña porción del émbolo esté dentro. Asegurándose de que el líquido no tenga fugas, gire la jeringa con la boquilla hacia arriba y retire la tapa.
- Todavía sosteniendo la jeringa con la boquilla hacia arriba, empuje el cilindro para disipar el aire hasta que el líquido de cultivo celular esté en la punta de la boquilla. Inserte la boquilla de la jeringa en el puerto de inyección manual del sistema de purificación y gírela para apretar.
- Empuje el émbolo hacia abajo hasta que toda la muestra se inyecte y sea visible en el circuito de muestra de gran volumen de 10 ml adjunto.
- Abra el archivo de método guardado. Guarde el archivo de resultados en la ubicación requerida y especifique el nombre del archivo cuando se le solicite. Presione ejecutar después de que la muestra se haya inyectado en el bucle de muestra de gran volumen.
- Ejecución del método de purificación
- Seleccione el método guardado y haga clic en ejecutar cuando se lo solicite el software del instrumento (paso 1.2.5).
nota: El sistema está configurado para ejecutar los siguientes pasos. El usuario no necesita hacer nada mientras el instrumento está funcionando.
- Equilibre la columna con tres volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrio a un caudal de 2 mL/min. Una vez que la columna está equilibrada, el sistema, utilizando el circuito de muestra de gran volumen, inyectará la muestra en la columna a un caudal de 1 mL/min.
- Una caída en la señal UV a 280 nm indica que la muestra ha terminado de cargarse. Lave la columna con tampón de equilibrio a un caudal de 2 mL/min hasta que la señal UV caiga por debajo de 25 mAU.
- Utilice cuatro CV de 25 mM de Tris con 1 M de NaCl a pH 7,5 para realizar un lavado secundario con alto contenido de sal a un caudal de 2 mL/min. El colector de fracciones del sistema recogerá cualquier proteína/ADN que se desprenda de la columna durante el lavado con sal en tubos de 50 ml.
- Aplique cinco CV de tampón de elución a un caudal de 1 mL/min para eluir el anticuerpo de la columna. Recoja el eluido en tubos de 15 mL según la señal UV; cuando la señal UV 280 está por encima de 35 mAU, se inicia la recolección; la recolección finaliza cuando la señal cae por debajo de 50 mAU; A esto se le llama corte de picos.
nota: El corte de picos garantiza la normalización de los perfiles de elución y evita la cola de los picos de elución, que pueden contener agregados de proteínas.
- Lave la columna con tres CV de tampón de equilibrio. La ejecución termina después del paso de lavado.
- Después de la elución, neutralice inmediatamente la proteína purificada utilizando una base de Tris 1 M a un pH de ~5,5. Mida la concentración de proteínas utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen a 280 nm y 260 nm y almacene a 4 °C.
