Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>PARTE 1: Establecimiento de cultivos neuronales disociados, fetales, de hipocampo de roedores
1. Pasos preparativos
- Recubrimiento de poli-L-lisina (PLL) de las superficies de recubrimiento (3 días antes de la disección)
- Prepare el tampón de borato añadiendo 2,38 g de ácido bórico y 1,27 g de bórax a 500 mL de agua destilada y removiendo durante 15 min hasta que se disuelva. Bajo una cubierta, esterilice la solución tampón filtrándola (tamaño de poro de 0,2 μm), etiquétela y almacene a temperatura ambiente (RT).
nota: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 6 meses.
PRECAUCIÓN: Al preparar el tampón de borato, use el equipo de protección personal recomendado.
- Prepare la solución madre de PLL (100 mg/mL) añadiendo 1 g de PLL a 10 mL de agua destilada y agitando hasta que se disuelva. Prepare 500 μL de alícuotas de solución madre de PLL. Para alcanzar una concentración final de 1 mg/mL, añadir 500 μL de alícuota de PLL a 50 mL de tampón de borato y agitar hasta que se disuelva, y esterilizar la solución filtrando (tamaño de poro de 0,2 μm).
nota: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 6 meses.
- Prepare las superficies para el recubrimiento. Utilice cubreobjetos de 12 mm de diámetro para los procedimientos de inmunotinción y placas con fondo de vidrio para los estudios que incluirán la obtención de imágenes de neuronas vivas. Si utiliza cubreobjetos, autoclave y luego coloque cinco cubreobjetos en cada plato (3,5 cm de diámetro).
nota: El grosor del cubreobjetos afecta a la calidad e intensidad de la señal de las imágenes adquiridas. La mayoría de los objetivos de microscopio están diseñados para cubreobjetos #1.5. Elija los cubreobjetos apropiados de acuerdo con la configuración y las técnicas de imagen.
- Debajo de una campana, agregue 1,5 ml de solución de PLL a cada plato (plato con fondo de vidrio o plato de 3,5 cm con cinco cubreobjetos). Asegúrese de que todos los cubreobjetos estén sumergidos y almacenados en RT durante 24 h.
- 2 días antes de la disección, aspire la solución de PLL y lave con agua estéril libre de endotoxinas, asegurándose de que los cubreobjetos estén sumergidos. Mantenga el agua en los platos y almacene en RT durante 24 h.
- 1 día antes de la disección, aspirar el agua y sustituirla por medios de cultivo NB + B27 (ver más abajo), y colocar las placas en una incubadora a 37 °C durante 24 h.
- Preparación de los medios de cultivo y de la solución madre (1 día antes de la disección)
- Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM): A 500 mL de DMEM Glucosa Alta (4,5 g/L) sin L-Glutamina y rojo de fenol, añadir 50 mL de suero de caballo, 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 10 mL de L-glutamina (200 mM), 10 mL de piruvato de sodio (100 mM), 10 mL de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Filtrar (tamaño de poro de 0,2 μm) y almacenar en alícuotas de 5 mL a 4 oC con el tapón bien cerrado.
nota: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 1 mes.
- Medio neurobasal (NB) suplementado con B27 (NB + B27): A 50 mL de medio NB sin rojo de fenol, agregue 1 mL de suplemento de B27.
- Medio Hibernate-E suplementado con B27 (Hibernate + B27): A 50 mL de medio Hibernate-E, agregue 1 mL de suplemento B27.
- Solución fisiológica extracelular (EPS): A 1 L de agua estéril, agregue lo siguiente en las concentraciones finales especificadas: NaCl (140 mM), KCl (3.5 mM), N-(2-Hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES, 10 mM), glucosa (20 mM) y CaCl2 (2 mM). Revuelva hasta que se disuelva y ajuste el pH a 7,4 agregando NaOH (0,5 M) o HCl (0,5 M). Bajo el capó, esterilizar por filtrado (tamaño de poro de 0,2 μm) y almacenar a 4 °C.
- Equipo y otros materiales de laboratorio (día de la disección)
- Ponga un baño de agua a 37 °C. Caliente las siguientes alícuotas: 50 mL de Solución Salina Balanceada (HBSS) de Hanks y 5 mL de DMEM.
- Esterilice las siguientes herramientas sumergiéndolas en un vaso de precipitados que contenga etanol absoluto (Figura 1B): pinzas, pinzas curvas, tijeras, pinzas curvas finas, pinzas rectas finas, tijeras quirúrgicas, pinzas de ángulo fino y tijeras de resorte de precisión.
nota: Para proteger las herramientas, coloque un material suave (por ejemplo, toallitas de precisión científica) en la parte inferior del vaso de precipitados.
- Llene dos bandejas con hielo y coloque los siguientes elementos.
- Bandeja de hielo 1 (Figura 1C): Colocar en el vaso de precipitados con etanol absoluto, un vaso de precipitados con HBSS para enjuagar los instrumentos quirúrgicos, un plato de 10 cm con HBSS para colocar los embriones, un plato de 6 cm con HBSS para colocar las cabezas de los embriones, y un plato de 6 cm con Hibernate + B27 para colocar los cerebros de los embriones.
- Bandeja de hielo 2: Colocar una alícuota de 1 mL de tripsina al 2,5% y un plato de 3,5 cm con Hibernate + B27 para el hipocampo disecado.
nota: El tiempo necesario para este procedimiento depende de la experiencia del investigador y del número de embriones a diseccionar. Por lo tanto, el hielo debe permanecer congelado durante el tiempo necesario. Para ello se recomiendan las bandejas de poliestireno.
>2. Disección y siembra (Figura 1)
- Aislamiento del hipocampo
nota: Las ratas preñadas con embriones en el día embrionario 18 (E18) son sacrificadas inmediatamente antes de que comience el protocolo de acuerdo con el comité de ética local de la Universidad de Barcelona, siguiendo la normativa europea (2010/63/UE) sobre el uso y cuidado de animales de experimentación. En este protocolo se utilizó la inhalación de dióxido de carbono (CO2) como método de eutanasia.
- Diseccionar la rata a nivel del peritoneo abdominal con pinzas y tijeras. Extraiga el útero con los embriones E18 y colóquelo en un plato de 10 cm que se haya enfriado con hielo.
NOTA: Es importante evitar que los pelos de rata se adhieran a los embriones. Se recomienda utilizar grandes cantidades de etanol al 70% para esterilizar el abdomen. A partir de este paso, trabaje dentro de la campana en la bandeja de hielo 1.
- Abra los sacos embrionarios y transfiera los embriones a la placa de 10 cm con HBSS, asegurándose de que los embriones estén completamente sumergidos.
- Retira la cabeza del embrión con unas tijeras y colócala en el plato de 6 cm con HBSS. Repite este proceso con todos los embriones.
nota: Para evitar la contaminación, todo el tejido, excepto la cabeza de los embriones, debe desecharse en un recipiente con tapón de rosca.
- Sujete la cabeza del embrión con pinzas de curvatura fina y perfore las órbitas con un par de pinzas de curvatura fina, entrando en un ángulo de 45°, y luego suelte las pinzas de curvatura fina.
nota: Las pinzas no deben atravesar el cerebro, por lo que es importante mantener el ángulo al entrar.
- Diseccionar la piel y el cráneo con las tijeras quirúrgicas, empezando por el hueso occipital hasta el hueso frontal. Retira el cerebro con un par de pinzas de curvatura fina y colócalo en el plato de 6 cm con Hibernate + B27. Repite este proceso hasta que se recuperen todos los cerebros.
- Separe sagitalmente los telencéfalos con las pinzas finas-rectas.
nota: A partir de este paso, la disección del hipocampo se realiza bajo un microscopio estereoscópico. Se recomienda utilizar lámparas articuladas para que la luz ilumine la superficie de disección desde los lados. También se recomienda utilizar un fondo negro ya que esto proporciona más contraste, permitiendo distinguir mejor el hipocampo.
- Prepare un plato de 10 cm colocando gotas de Hibernate + B27 a distancias de 1 cm (por ejemplo, en un círculo). Coloque un telencéfalo por gota de Hibernate + B27 y visualice a través del visor de disección (se recomienda un aumento del objetivo de 1,25x).
- Pelar con cuidado las meninges y retirar el tálamo para visualizar mejor el hipocampo.
- Disecciona el hipocampo con las tijeras de resorte de precisión y colócalo en el plato de 3,5 cm con Hibernate + B27 en la bandeja de hielo 2. Repita para cada telencéfalo hasta que se recojan todos los hipocampos.
- Recoja cuidadosamente todos los hipocampos con una pipeta Pasteur y transfiéralos a un tubo de 50 ml.
nota: Tomar el volumen mínimo de Hibernate + B27 al recoger los hipocampos para no diluir la tripsina.
- Disociación celular
- Disociación enzimática del hipocampo
- En el tubo de 50 mL que contiene el hipocampo, agregue 1 mL de tripsina al 2,5% y llévelo a un volumen de 5 mL con HBSS. Incubar durante 15 min en el baño de agua a 37 °C.
- Para diluir la tripsina, añadir 10 mL de HBSS precalentado e incubar durante 5 min en el baño de agua a 37 °C.
- Transfiera los hipocampos que ahora aparecen como una masa mucosa a un tubo de 50 mL con una micropipeta de 1.000 μL, agregue 6 mL de HBSS precalentado e incube durante 5 min en el baño de agua a 37 °C.
- Disociación mecánica del hipocampo
- Transfiera la masa a un tubo de 2 mL con fondo cónico, tomando el volumen mínimo. Agregue 1 mL de medio DMEM precalentado. Homogeneizar el pellet con una micropipeta de 1.000 μL aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
nota: Es fundamental evitar generar burbujas al aspirar, ya que las burbujas pueden lisar las células.
- Repita la aspiración hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio preextraída (10x-20x), con su punta en contacto con el fondo cónico del tubo. Evita generar burbujas. Al final de este paso, la mezcla debe ser translúcida.
- Una vez mezclada de forma homogénea, transfiera la mezcla a un tubo que contenga 4 ml de medio DMEM a 37 °C y homogeneice con una pipeta de vidrio pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Siembra de células
- Cuenta las celdas. El número de neuronas en la solución se puede contar de acuerdo con los procedimientos estándar de laboratorio.
nota: En experimentos de imagen para la detección de anticuerpos y la actividad del calcio, lo óptimo es una concentración de 50.000 células por plato de 3,5 cm.
- Manteniendo las celdas suspendidas, extraiga el volumen calculado y coloque en placas de 3,5 cm que contengan cubreobjetos recubiertos de PLL o en placas con fondo de vidrio recubiertas de PLL.
- Distribuya uniformemente las celdas en las placas agitándolas suavemente con movimientos cruzados (hacia adelante y hacia atrás, luego de lado a lado; repita según sea necesario) y coloque las placas en la incub>2 (5%).
nota: Es importante utilizar movimientos cruzados para evitar que las células se asienten en la periferia de la placa.
- Cada semana, agregue aproximadamente 1 mL de NB + B27, para que el cultivo no se seque.
nota: Después de 2 semanas (14 días in vitro [div]), las neuronas están maduras y expresan todos los factores que se utilizarán para la experimentación. El número medio total de neuronas obtenidas mediante este protocolo es de aproximadamente 2,5 x 106 neuronas procedentes de una media de 12 embriones E18 por rata preñada.
>PARTE 2: Uso de cultivos neuronales del hipocampo para la detección de anticuerpos en proteínas de la superficie de las células neuronales
NOTA: Esta parte del protocolo demuestra cómo se utilizan los cultivos de hipocampo para identificar anticuerpos anti-NMDAR en el suero y/o LCR de pacientes con encefalitis anti-NMDAR. La inmunotinción fluorescente se utiliza para visualizar la reactividad en las neuronas vivas, pero también se podrían utilizar otros métodos de visualización. Un control apropiado para este experimento sería el suero o el líquido cefalorraquídeo de un individuo sano. Al utilizar muestras humanas, tenga en cuenta que puede ser necesaria la aprobación del comité de ética institucional.
>3. Inmunotinción fluorescente en vivo
- Utilice 14 células div que se hayan cultivado en cubreobjetos (50.000 células por plato de 3,5 cm que contenga cinco cubreobjetos).
- En el interior de la campana, enjuague los cubreobjetos con NB precalentado a 37 °C.
- Añadir la muestra que en este caso contiene anticuerpos anti-NMDAR (utilizados como anticuerpo primario) diluidos en medios NB a 1:200 para el suero o 1:2 para el LCR e incubar 1 h a 37 °C (dentro de la incubadora de CO2 (5%).
- Enjuague cuidadosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces en RT.
- Agregue la solución de fijación (4% de formaldehído en PBS) e incube en RT durante 5 min.
cautela: Cuando manipule un 4% de formaldehído, trabaje dentro del capó y use el equipo de protección personal recomendado.
- Lavar 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una.
- Añadir el anticuerpo secundario Goat anti-Human AF488 con una dilución de 1:1000 e incubar a RT durante 1 h.
nota: Durante la incubación, protéjase de la exposición a la luz cubriéndolo con papel de aluminio.
- Lavar 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una. Enjuague con agua destilada
- Monte los cubreobjetos con un medio de montaje líquido (por ejemplo, un medio de montaje antidecoloración con DAPI; aproximadamente 7 μL), aspire el líquido restante y enjuague con agua destilada. Las neuronas ya están listas para la obtención de imágenes de fluorescencia.
cautela: Cuando manipule el medio de montaje, use el equipo de protección personal recomendado.
