>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una campana BSL2 a menos que se indique lo contrario. Se requiere una titulación viral antes de un ensayo de neutralización por reducción de placas (PRN) para determinar la concentración óptima de RSV utilizada en el ensayo PRN. Se recomienda alícuota las existencias de virus en un pequeño volumen que se descongelará una vez y se utilizará para cada ensayo de NAb. También se recomienda utilizar el mismo material viral para todos los ensayos de NAb realizados para todas las muestras de un estudio. Asegúrese de que los medios de cultivo y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) se calienten a 37 °C antes de agregarlos a las placas celulares.
1. Titulación viral del VRS
NOTA: Dependiendo del número de existencias de virus y del número de duplicados, la placa de ensayo se puede configurar de acuerdo con la Figura 1. Cada stock de virus debe valorarse por triplicado en la placa de ensayo, comenzando con la concentración viral más alta (es decir, 1:10). Las valoraciones en serie pueden ser típicamente 1:10. Los procedimientos de cultivo y mantenimiento celular A549 y de cultivo de VRS se realizan utilizando procedimientos estándar y no se incluyen en este protocolo.
- Placas de siembra (Día 1)
- Vuelva a suspender las células A549 en el medio Modified Eagles de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero fetal de ternera (FCS) + 1000 UI de penicilina/estreptomicina (pluma/estreptococo) a 4 x 105/mL. Siembre placas estériles de fondo plano de 96 pocillos con 100 μL/pocillo que contienen 4 x 104 células A459.
- Incubar las placas durante la noche a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2) (las células estarán en la fase de crecimiento logarítmico).
nota: Use un nuevo vial de células A549 después de 23 pasadas. Se recomienda no iniciar los experimentos cuando un nuevo vial de células aún se encuentra en los tres primeros pasajes.
- Infección por virus (Día 2)
- Preparación de la dilución en serie del virus
- Descongele rápidamente un solo vial congelado del virus respiratorio sincitial (VRS) en un baño de agua a 37 °C hasta que esté casi completamente descongelado y colóquelo inmediatamente en hielo. Prepare 3 réplicas para cada stock de virus RSV que se va a analizar, utilice una dilución inicial de stock de virus de 1:10 con 100 μL de virus/pocillo diluido y reserve al menos una columna para el control negativo.
NOTA: En la figura 1 se muestra el control negativo por triplicado.
- Añadir 100 μL de cada virus diluido a 1:10 por triplicado de la fila A de una placa estéril de 96 pocillos con fondo en U. Añada 90 μL/pocillo de DMEM + 1000 UI de pluma/estreptococo sin FCS a las filas B a H.
- Realice diluciones en serie 1:10 en la placa transfiriendo 10 μL de la fila A a la fila B. Mezcle la solución pipeteando el contenido hacia arriba y hacia abajo 5 veces y continúe las diluciones diez veces hasta la fila H. Deseche los últimos 10 μL de modo que el volumen final en cada pocillo sea de 90 μL.
NOTA: Es importante utilizar puntas nuevas para cada dilución.
- Inoculación del virus a células A549
- Recupere la(s) placa(s) de celda A549 preparada(s) el día anterior. Asegúrese de que las monocapas de celdas A549 en las placas de 96 pocillos sean ~80% confluentes. Deseche el medio invirtiendo suavemente la placa y secándola ligeramente sobre una toalla de papel absorbente estéril.
- Lave todos los pocillos con 100 μL de PBS dos veces; deseche el exceso de PBS invirtiendo suavemente la placa y secando ligeramente una toalla de papel absorbente estéril después de cada lavado. No permita que los platos se sequen.
- Transfiera las diluciones del virus de la placa de valoración viral (Figura 1) a los pocillos correspondientes en la placa de células A549. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C, 5% CO2. Después de 1 h de incubación, decantar los sobrenadantes con una pipeta (para evitar la contaminación cruzada). Sacar 90 μL/pocillo.
- Agregue 100 μL de 1x medio 199 (M199, ver Tabla de Materiales) + 1.5% de sal sódica de carboximetilcelulosa (CMC) de baja viscosidad + 2% de FCS que contiene pluma/estreptococo a cada pocillo.
NOTA: Se deben preparar y almacenar a 4 °C 2 soluciones de M199 + 4 % de FCS + 2 % de pluma/estreptococo y 3 % de CMC para su uso futuro. Asegúrese de que la solución esté tibia a 37 °C antes de añadirla a las placas.
- Prepare 2 soluciones M199: 1 sobre/500 ml de agua destilada + 20 ml de FCS + 10 ml de pluma/estreptococo (para formar 2 x MI99). Filtre la solución con una unidad de filtro de 0,22 μm.
- Para la preparación de CMC al 3%, agregue 15 g de CMC lentamente en 500 mL de agua destilada. Disuelva el CMC en agua utilizando un agitador metálico a 50 °C, que tarda aproximadamente 1 hora en prepararse. Mezcle bien para hacer CMC al 3% y autoclave la solución.
NOTA: El sólido CMC debe agregarse al agua que se va a disolver; Agregar agua al sólido seco produce un "grupo" de sólido que es muy difícil de disolver.
- Prepare 1x M199 + 1,5% CMC de baja viscosidad + 2% FCS que contiene pluma/estreptococo mezclando 1:1 los 2x M199 y 3% CMC preparados en el paso 1.2.2.4.2.
- Placa de incubación durante 3 días a 37 °C, 5% CO2.
- Desarrollo de la placa de ensayo y el análisis (Día 5)
- Placa de ensayo de fijación y revelado
- Deseche M199 + CMC + 2% FCS que contenga pluma/estreptococo invirtiendo suavemente la placa. Añadir lentamente (para evitar alterar la capa celular) 200 μL de tampón de fijación (80% acetona, 20% PBS, almacenado a -20 °C) para fijar las células. Incubar a -20 °C durante 20 min.
- Deseche el tampón de fijación y séquelo suavemente sobre una toalla de papel absorbente. Deje el plato boca abajo para que se seque durante 10 minutos.
nota: A partir de este paso, el ensayo se puede realizar fuera de la campana BSL2.
- Prepare una solución bloqueadora de diluyente de leche al 5% en PBS filtrado que contenga 0,05% de polisorbato 20 (PBS-polisorbato, ver Tabla de Materiales). Calcule el volumen necesario para el bloqueo de una placa en función de 200 pocillos/pocillo y 110 pocillos: 200 μL/pocillo x 110 pocillos = 22 mL (1,1 mL de diluyente de leche concentrada en 20,9 mL de polisorbato de PBS filtrado). En esta etapa, también constituya una solución de bloqueo suficiente para los anticuerpos primarios y secundarios. Calcule el volumen necesario para cada solución de anticuerpos para una placa en función de 50 μL/pocillo y 110 pocillos: 50 μL/pocillo x 110 pocillos = 5,5 mL. Por lo tanto, el volumen total de solución de bloqueo de diluyente de leche requerido para un ensayo de placa única es de 33 mL.
- Añadir 200 μL/pocillo de solución de bloqueo. Incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 30 min. Deseche la solución invirtiendo suavemente el plato y séquelo con una toalla de papel absorbente.
- Prepare 1:500 Anticuerpo RSV de Cabra X (mAb – anticuerpo primario) diluido en solución bloqueante. Añadir 50 μL/pocillo de la solución de mAb e incubar a 37 °C durante 1 h. Lave la placa 3 veces con polisorbato PBS filtrado.
- Prepare 1:5,000 Alexa-Fluor burro anti-cabra IgG (anticuerpo secundario) diluido en solución bloqueante. Añadir 50 μL/pocillo de la solución de anticuerpos secundarios e incubar a 37 °C durante 1 h. Lave la placa 5 veces con polisorbato PBS filtrado.
- Lea la placa en un lector puntual automático utilizando el canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y los ajustes de recuento, como se muestra en la Figura 2. Envuelva la placa en papel de aluminio y guárdela a 4 °C. Calibre el instrumento utilizando una placa de cultivo de 96 pocillos sin usar e ingresando los ajustes de conteo antes del ensayo.
nota: Si es necesario, es posible volver a escanear en unos pocos días. La calibración y el ajuste de recuento se pueden guardar y utilizar para futuros escaneos si el ensayo utiliza el mismo tipo de placa utilizada para la calibración.
- Revise las imágenes de los pocillos en busca de placas de artefactos o monocapas celulares interrumpidas (Figura 3). Excluir pozos con monocapas celulares interrumpidas.
nota: Dependiendo del tamaño de las placas de artefactos, es posible que sea necesario realizar recuentos manuales para esos pozos, o que esos pozos deban descartarse del análisis de datos. Los criterios para un resultado válido incluyen que no se hayan detectado placas de artefactos o monocapa de células interrumpidas en más de un pocillo replicado y que no se hayan detectado unidades formadoras de placas (PFU) en pocillos negativos (pocillos sin virus añadidos).
- Determinar las concentraciones virales
- Elija las dos últimas diluciones en las que las manchas se puedan contar claramente. Calcule el número promedio de puntos de pozos replicados en la misma dilución. Calcule el título viral (PFU por mL) de la muestra de stock utilizando la siguiente fórmula:
PFU/mL = Número promedio de placas/(Factor de dilución × Volumen de virus diluido agregado al pocillo)
nota: La concentración de virus determinada para cada stock de VRS ahora se puede utilizar en el ensayo PRN (paso 2).
>2. Ensayo de neutralización del VRS
- Placas de siembra (Día 1)
- Vuelva a suspender las células A549 en DMEM + 10% FCS + 1000 UI de pluma/estreptococo a 4 x 105/mL. Siembre placas estériles de fondo plano de 96 pocillos con 100 μL/pocillo que contengan 4 x 104 células A459 y placas de incubación durante la noche a 37 °C, 5% de CO2 (las células estarán en la fase de crecimiento logarítmico).
nota: Use un nuevo vial de células A549 después de 23 pasadas. No se recomienda utilizar las pilas A549 antes del pasaje número 3.
- Preparación de virus y suero (Día 2)
nota: Dependiendo del tipo de muestra, hay pasos necesarios para el preprocesamiento de muestras antes del ensayo NAb. Se recomienda utilizar los sueros estándar internacionales VRS que ya están disponibles a petición del Instituto Nacional de Normas y Controles Biológicos (NIBSC).
- Preparación de la dilución sérica
- Descongele el antisuero de referencia para el VRS humano (suero de referencia, REF) y las muestras de prueba de suero en RT. Inactive por calor las muestras de suero y el antisuero de referencia en un baño de agua a 56 °C durante 30 minutos antes de su uso. Prepare las diluciones según la plantilla de la placa (Figura 4).
- Prepare una dilución 1:100 del REF. Prepare un mínimo de 110 μL de REF diluido en DMEM + pen/estreptococo sin FCS por placa de ensayo (por ejemplo, 1,5 μL de REF en un volumen total de 150 μL). Añadir 110 μL de REF diluido 1:100 en el pocillo A12 de una placa estéril de fondo en U de 96 pocillos.
- Añadir 55 μL de DMEM + pena/estreptococo sin FCS a los pocillos B12 a H12 de la columna 12. Realice diluciones en serie 1:2 en la placa transfiriendo 55 μL de la fila A a la fila B, mezclando la solución pipeteando el contenido hacia arriba y hacia abajo 5 veces y continuando hasta la fila H. Deseche los últimos 55 μL de medio de modo que el volumen final en cada pocillo sea de 55 μL. Use puntas nuevas para cada dilución.
- Prepare una dilución 1:100 de las muestras de prueba de suero. Dado que todas las muestras de suero se analizan por triplicado, prepare un volumen mínimo de 110 μL/pocillo x 3 = 330 μL por muestra de suero.
- Añadir 110 μL de cada muestra de suero diluido (1:100; S1 = suero 1, S2 = suero 2, etc.) a los pocillos correspondientes A1 a A9 y también E1 a E9 de la placa estéril de 96 pocillos según la Figura 4.
- Añada 55 μL de DMEM + pluma/estreptococo sin FCS a todos los pocillos marcados con la letra X. Realice diluciones en serie 1:2 según el paso 2.2.1.3 hasta la fila D (para las muestras 1, 2 y 3). Deseche los últimos 55 μL de medio de modo que el volumen final en cada pocillo sea de 55 μL. Del mismo modo, realice las diluciones en serie 1:2 para las muestras 4, 5 y 6 para las filas E a H.
nota: Es fundamental utilizar nuevas puntas para cada dilución.
- Añadir 55 μL de DMEM + pena/estreptococo sin FCS a los pocillos de las columnas 10 y 11.
- Preparación del virus
- Descongele rápidamente un solo vial congelado de VRS en un baño de agua a 37 °C hasta que esté casi completamente descongelado y colóquelo inmediatamente en hielo.
- Diluir el virus en DMEM + pena/estreptococo sin FCS sobre la base de la concentración de la alícuota del VRS determinada en el paso 1.3.2. Aplique una dilución que dé aproximadamente 200 UFP/pocillo. Prepare un volumen total de 5,5 mL (para 100 pocillos).
- Preparación de la mezcla virus-suero
- Añada 55 μL del virus diluido a todos los pocillos de las columnas 1 a 9 y a los pocillos de las filas E-H de las columnas 10 y 11 (control positivo) de acuerdo con la plantilla de la placa (Figura 4).
- Añadir 55 μL de DMEM + pen/estreptococo sin FCS a todos los pocillos de las filas A-D de las columnas 10 y 11 (control negativo). Incubar la placa durante 1 h a 37 °C, 5% CO2.
- Inoculación del virus a células A549
- Antes de completar el período de incubación, recupere la(s) placa(s) celular(es) A549 preparada(s) en el paso 2.1.1. Asegúrese de que las monocapas de celdas A549 en las placas de 96 pocillos sean ~80% confluentes.
- Deseche el medio invirtiendo suavemente la placa y secándola ligeramente sobre una toalla de papel absorbente estéril. Lave todos los pocillos con 100 μL de PBS dos veces, deseche el exceso de PBS invirtiendo suavemente la placa y secando ligeramente una toalla de papel absorbente estéril después de cada lavado. No permita que los platos se sequen.
- Transfiera 100 μL/pocillo de la mezcla de virus y suero a los pocillos correspondientes en la placa de células A549 siguiendo la plantilla de placa. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C, 5% CO2.
- Después de 1 h, con una pipeta, saque 90 μL/pocillo y agregue 100 μL de 1x M199 precalentado + 1,5% CMC + 2% FCS + pluma/estreptococo. Placa de incubación durante 3 días a 37 °C, 5% CO2.
nota: Asegúrese de que la solución se caliente a 37 °C antes de agregarla a las placas.
- Desarrollo de la placa de ensayo y el análisis (Día 5)
- Desarrollar la placa de fijación y ensayo siguiendo los pasos 1.3.1.1 a 1.3.1.8.
- Determinar el título de neutralización del 50%
- Determine el título de neutralización del 50% calculando la distancia proporcional entre las diluciones recíprocas de suero por encima y por debajo del 50% de los pocillos de control "sin suero" (control de virus positivo - columna 10, filas E-H).
- Cuente el número de PFU (es decir, placas) que surgen de infecciones virales individuales en pocillos de suero y sin pocillos de control de suero. Calcule el número medio de PFU de los pocillos de control sin suero y determine el valor del 50%.
- Identifique las diluciones de suero con recuentos inmediatamente por encima y por debajo del valor del 50% de los pocillos de control sin suero. Utilizando un gráfico semilogarítmico o una plantilla de hoja de cálculo, trace el número de PFU en el eje x (escala lineal) y la dilución recíproca del suero en el eje y (escala logarítmica10). Trace una línea entre los dos puntos y lea los títulos de neutralización del 50% de las muestras de suero de prueba de esta línea.
