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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación del tampón
- Tampón de etiquetado (2x solución salina tamponada con fosfato, (PBS), pH 7.9): En 400 mL de agua destilada desionizada (DD), agregue 100 mL de 10x PBS, ajuste el pH a 7.9 con hidróxido de sodio (NaOH).
- 3 mM de biotina: Disuelva 1 mg de biotina en 588 μL de tampón de etiquetado.
- 3 mM de Sulfo-tag: Disuelva 150 nmol de Sulfo-tag en 50 μL de tampón de etiquetado.
- Tampón de antígenos (5% BSA): En 500 mL de 1x PBS, añadir 25 g de Albúmina Suférica Bovina (BSA).
- Prepare una solución de ácido acético de 0,5 M.
- 1,0 M de tampón Tris-HCl pH 9,0: Prepare 1 M de tampón Tris-HCl y ajuste el pH a 9,0 con HCl.
- Tampón de recubrimiento (3% Blocker A): En 500 mL de 1x PBS, agregue 15 g de Blocker A.
- Tampón de lavado (0,05 % Tween 20, PBST): En 5000 mL de 1x PBS, agregue 2,5 mL de Tween 20.
- Tampón de lectura (2x Tampón de lectura T con surfactante): En 500 mL de agua DD, agregue 500 mL de tampón de lectura 4x T con surfactante (Tabla de materiales).
- Almacene la biotina y el sulfoetiquetado en un congelador a -20 °C.
nota: Tanto las soluciones de biotina como las de sulfo-tag siempre deben estar recién preparadas justo antes del procedimiento de etiquetado.
>2. Etiquete el autoantígeno de los islotes humanos con biotina y sulfo-tag
NOTA: Se recomienda una alta concentración de antígeno, ≥0,5 mg/mL, para una reacción de marcaje más eficiente.
- Determinar la proporción molar del autoantígeno de los islotes humanos para la biotina y el sulfo-tag.
- Obtenga el número molar del antígeno dividiendo el peso del antígeno por el peso molecular.
- Utilice la relación molar de 1:5 para el antígeno con menor peso molecular (≤10 kd) y la relación molar de 1:20 para el antígeno con mayor peso molecular (>50 kd).
- Calcule el volumen de biotina o sulfo-tag dividiendo el número molar por su concentración.
- Mezclar el autoantígeno de los islotes humanos con biotina o sulfo-tag con una proporción molar de 1:5.
nota: La proteína en los sistemas tampón de tris o glicina debe intercambiarse por un tampón PBS 2x con un pH de 7,9 utilizando la columna de espín de tamaño.
- Dado que la biotina y el sulfo-tag son sensibles a la luz, cubra los tubos de reacción con papel de aluminio. Incubar la reacción a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
- Durante la incubación, cebe la columna de centrifugación dispensando 2 veces tampón PBS en la columna tres veces. Centrifugar la solución a 1000 x g durante 2 minutos cada vez.
nota: En la actualidad, la reacción de etiquetado, a través del puente, sigue ocurriendo y es necesario detenerla.
- Detenga la reacción de marcaje purificando el autoantígeno de los islotes humanos marcados. Para purificar, pase el autoantígeno a través de la columna de centrifugación y centrifugue la columna a 1000 x g durante 2 min.
- Determine la concentración de antígeno marcado (μg/μL) utilizando la cantidad de proteína de antígeno y el volumen final.
nota: Aproximadamente, habrá una retención del 90 al 95% del antígeno marcado después de cada paso de la columna de centrifugado.
- Alicuente el antígeno marcado y almacene el antígeno marcado a -80 °C.
>3. Defina las mejores concentraciones y proporciones para los dos antígenos marcados para el ensayo (ensayo de tablero de ajedrez)
- Prepare dos muestras de suero, una positiva y otra negativa, con un volumen total de 200 μL para cada una.
- Alícuota 4 μL de suero y añadir 1x PBS hasta que el volumen final sea de 20 μL por pocillo para una placa de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 96 pocillos. Use la mitad de una placa para la muestra con alto positividad y la otra mitad para la muestra negativa, como se muestra en la Figura 1A.
- Agregue 10 μL de biotina y 10 μL de antígeno marcado con Sulfo-tag y realice diluciones en serie para los dos antígenos marcados de manera diferente, como se muestra en la Figura 1A. Ejecute una dilución serial horizontal para un antígeno marcado y una dilución serial vertical para el otro antígeno marcado.
- Continúe con el resto de los pasos de ensayo descritos en 5.3 a 9.1.
- Calcule la relación entre las señales de la muestra positiva alta y cada una de las señales correspondientes de la muestra negativa que se muestra en la Figura 1B.
- Identifique las mejores concentraciones para los antígenos marcados con biotina y sulfo-tag seleccionando un punto con la proporción más alta o casi más alta de positivo a negativo. Considere la señal de fondo baja de la muestra negativa para identificar la proporción.
nota: El día 1 del ensayo incluye los pasos 4 a 6.
>4. Prepare el tampón de antígenos utilizando la concentración correcta de antígeno marcado con biotina/sulfoetiqueta
- Seleccione la concentración racional de cada antígeno en función del ensayo de tablero de ajedrez.
- Prepare 3 mL de solución de antígeno por placa, utilizando la concentración racional de antígeno marcado con biotina/sulfo-tag para el tampón de antígeno.
>5. Incubar muestras de suero con antígeno marcado
NOTA: Hay dos protocolos en esta sección, uno sin tratamiento con ácido sérico y otro con tratamiento con ácido sérico. Todos los ensayos de autoanticuerpos de los islotes, excepto el ensayo de autoanticuerpos de insulina (IAA), utilizan un protocolo regular sin tratamiento con ácido sérico de los pasos 5.1 a 5.5, mientras que el ensayo de IAA omite estos pasos y utiliza un protocolo con tratamiento con ácido sérico de los pasos 5.6 a 5.9.
- Alícuota 4 μL de suero y añadir 1x PBS hasta que el volumen final sea de 20 μL por pocillo para una placa de PCR de 96 pocillos.
- Añadir 20 μL de solución de antígeno marcado por pocillo.
- Cubra la placa PCR con papel de sellado para evitar la luz.
- Coloque la placa en un agitador (baja velocidad) a RT durante 2 h.
- Coloque la placa en el refrigerador a 4 °C e incube durante la noche (18 - 24 h).
nota: El siguiente protocolo de pasos de 5.6 a 5.9 solo está diseñado para el ensayo IAA y otros ensayos de autoanticuerpos, omita estos pasos.
- Mezclar 15 μL de suero con 18 μL de ácido acético 0,5 M por cada muestra de suero. Incuba esta mezcla a RT durante 45 min.
- Prepare la solución de antígeno con la concentración racional de biotina y antígeno marcado con sulfo-tag, según el ensayo de tablero de ajedrez, utilizando tampón de antígeno. En cada pocillo, se alicucuentan 35 μL de tampón de antígeno, que contiene biotina y antígeno marcado con sulfo-tag, en una nueva placa de PCR.
- Antes de finalizar el paso de incubación de 45 min (paso 5.6), agregue 8,3 μL de tampón Tris pH 9.0 de 1 M al lado de cada pocillo en la placa de antígenos (paso 5.6). Es importante limitar la mezcla entre el tampón Tris y el antígeno. Transfiera inmediatamente 25 μL del suero, que se trata con ácido, en el paso 5.6, a cada pocillo y agite la solución. Cubra la placa PCR con papel de sellado para evitar la luz.
- Coloque la placa en un agitador (baja velocidad) a RT durante 2 h. Coloque la placa en el refrigerador a 4 °C y deje que la placa se incube durante la noche (18 - 24 h).
>6. Prepare la placa de estreptavidina
- Tome una placa de estreptavidina del refrigerador a 4 °C y deje que la placa llegue a RT.
- Una vez que la placa de estreptavidina esté en RT, agregue 150 μL de bloqueador A al 3% a cada pocillo.
- Cubra la placa PCR con papel de sellado.
- Incubar la placa en el refrigerador a 4 °C durante la noche.
NOTA: El día 2 del ensayo incluye los pasos 7 a 9.
>7. Transfiera las incubaciones de suero/antígeno a la placa de estreptavidina
- Al día siguiente, saque la placa de estreptavidina del refrigerador y deseche el tampón de la placa. Coloque algunas toallas de papel secas sobre la mesa y golpee el plato boca abajo hasta que no haya más tampón dentro de los pozos.
- Llene la placa vacía de estreptavidina con 150 μL de PBST por pocillo y deseche el PBST de la placa durante un total de tres lavados.
- Transfiera 30 μL de incubaciones de suero/antígeno por pocillo a la placa de estreptavidina.
- Cubra el plato con papel de aluminio para evitar la luz. Agite la placa, a temperatura baja, a RT durante 1 h.
>8. Lave la placa y agregue un tampón de lectura
- Deseche las incubaciones del plato. Agregue 150 μL de PBST por pocillo y deseche el PBST de la placa para un total de tres lavados.
- Después del lavado, agregue 150 μL por pocillo de tampón de lectura.
nota: Es importante evitar las burbujas de aire en la solución porque esto afectará la forma en que se lee la placa en la máquina lectora de placas.
