Un inmunoensayo en papel para la detección de inmunoglobulina G

Resumen

Fuente: Peng, Y. et al., Unión covalente de anticuerpos a discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en inmunoensayos colorimétricos a simple vista.J. Vis. Exp. (2016)

El video muestra un inmunoensayo en papel, que involucra discos de celulosa funcionalizados con amina reticulados con glutaraldehído. La inmovilización covalente de anticuerpos de captura específicos de IgG-Fc, seguida de la introducción de anticuerpos de detección conjugados con inmunoglobulina G y peroxidasa de rábano picante, da como resultado un cambio de color que confirma la presencia de inmunoglobulina G.

Protocolo

>1. Injerto de grupos funcionales de amina en discos de papel de celulosa

1. Prepare una hoja de papel cuadrado con una dimensión de 1 cm × 1 cm, y 100 discos de papel hechos de papel de celulosa de grado No. 1 con un diámetro de 6,0 mm (papel de filtro de flujo medio) con una perforadora.
2. Para obtener los grupos -NH₂ en los discos de papel, mezcle 1 ml de 3-aminopropiltrimetoxisilano (APS) y 10 ml de acetona en un frasco de vidrio de 50 ml en la campana extractora. Añada discos de papel a la mezcla de reactivos APS recién preparada e incube durante 5 horas con agitación orbital (200 rpm) a temperatura ambiente.
   cautela: Manipule APS y acetona en la campana extractora.
3. Decantar el exceso de solución de la botella de vidrio de 50 ml en un contenedor de residuos orgánicos.
4. Agregue 10 ml de acetona a la botella de vidrio, mezcle bien y decante completamente para eliminar cualquier APS no reaccionado y otras impurezas. Repita este paso dos veces.
5. Extienda los discos de papel sobre la toalla de papel y colóquelos en un horno a 110 °C durante 3 horas. Deje que los discos de papel se enfríen. Guarde los discos en un tubo de centrífuga de 50 ml a temperatura ambiente.
6. Utilice la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) para comprobar el injerto de grupos amina en el papel cuadrado de celulosa, como se describe a continuación (Figura 1A).
   1. Encienda la computadora y abra el instrumento de espectroscopia FTIR.
   2. Abra el software para la espectroscopia FTIR.
   3. Vaya a 'Medición → inicializar'. Los rectángulos de 'BS: KBr', 'Lamp: Infrared' y 'Laser' se volverán verdes cuando finalice la inicialización.
   4. Elija 'Datos' debajo de los rectángulos y seleccione '%Transmitancia', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' y 'Mín.: 400, Máx.: 4000' para 'Modo de medición', 'Apodización', 'N.º de escaneos', 'Resolución' y 'Rango (cm-1)'.
   5. Haga clic en 'Medir'.
   6. Seleccione 'Archivo de datos' para los datos en segundo plano. Escribe los comentarios.
   7. Haga clic en 'BKG' para obtener la línea de base para el fondo.
   8. Fije el papel cuadrado en el portamuestras de película.
   9. Seleccione 'Archivo de datos' para los datos de muestra. Escribe los comentarios.
   10. Haga clic en 'Muestra' para obtener los espectros de la muestra.
   11. Cierre la aplicación de espectroscopia FTIR y apague el equipo.
7. Repita los pasos anteriores (pasos 1.1 a 1.6) para preparar papel y discos cuadrados de celulosa de grado n.º 113 funcionalizados con aminas (papel de filtro de flujo rápido) y obtenga los espectros FTIR para el papel cuadrado de grado n.º 113 (Figura 1B).

>2. Ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) basado en papel para la detección de inmunoglobulina G (IgG)

1. Añadir 5 ml de solución de glutaraldehído al 0,05% (preparada en tampón PBS de 50 mM, pH 7,4) a un frasco de vidrio de 20 ml. Sumerja 15 discos de papel de filtro de flujo medio funcionalizados con aminas en esta solución y manténgalos durante 1 hora agitándolos a temperatura ambiente.
   1. Al mismo tiempo, repita el paso 2.1 para preparar otros 15 discos de papel de filtro de flujo rápido funcionalizados con aldehído.
      cautela: Manipule el glutaraldehído en la campana extractora.
2. Para eliminar el glutaraldehído no reaccionado de los discos de papel, coloque los 15 discos de papel de filtro de flujo medio en un tubo de centrífuga de 15 ml y los 15 discos de papel de filtro de flujo rápido en otro tubo de centrífuga de 15 ml. Agregue 5 ml de agua desionizada a cada tubo y agite los tubos durante 10 segundos. Retire el agua aspirando con una pipeta. Repita dos veces para eliminar el glutaraldehído que no haya reaccionado.
3. Seque los discos de papel en un horno a 37 °C.
4. Añadir 5 μl y 8 μl de fragmentos de anticuerpos IgG-Fc de ratón de 0,025 mg/ml a cada uno de los discos de papel de filtro de flujo medio y de flujo rápido, respectivamente, e incubar durante 20 min.
5. Añadir 10 μl de 50 mM de PBS (pH 7,4) a cada disco de papel sin eliminar los anticuerpos e incubar durante 40 min para la reacción de aldehído de amina.
6. Lave los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado encima de una toalla de papel. Repite el lavado tres veces.
7. Seque los discos de papel en un horno a 37 °C.
8. Bloquee los discos de papel con 15 μl de tampón de bloqueo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
9. Lave cada disco de papel con 0,2 ml de tampón de lavado encima de una toalla de papel. Repite el lavado tres veces.
10. Ejecutar estándares de IgG.
    1. Cargue 10 μl de varias concentraciones de IgG (por ejemplo, 0, 10, 125, 250 y 500 ng/ml en PBS) en cada disco por triplicado. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
11. Lave los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado encima de una toalla de papel. Repite el lavado tres veces.
12. Cargue 10 μl de anticuerpos IgG-Fc de ratón conjugados con HRP (1:10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) e incube durante 1 hora a temperatura ambiente.
13. Lave los discos de papel con 0,2 ml de tampón de lavado encima de una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.
    nota: No es necesario quitar el tampón de lavado, ya que los resultados no se ven afectados por la presencia de tampón.
14. Cargue una mezcla de 10 μl de TMB y peróxido de hidrógeno en cada disco.
15. Tome imágenes de todos los discos de papel con una cámara digital o un teléfono inteligente después de 5 minutos de incubación><. nota: En la figura 2A, '0' representa los discos de papel tratados con inmovilización de anticuerpos de captura y la solución de anticuerpos-HRP/TMB sin suero de IgG.
16. Analice la intensidad de cada disco de papel en la imagen de la Imagen J.
    1. Convierta las imágenes tomadas en el paso 3.15 al formato '.tif'.
    2. Abra el software 'Image J'.
    3. Vaya a 'Archivo → abrir', elija la imagen a analizar.
    4. Elija el botón de forma 'Óvalo'.
    5. Vaya a 'Tipo de imagen → → 32 bits'.
    6. Ve a 'Editar → invertir'.
    7. Ve a 'Analizar → medir'.
    8. Copie y analice los datos en una hoja de cálculo.

Resultados

Figura 1.Espectros infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) de papel cuadrado de filtro de flujo medio (A) sin tratar y tratado con APS y papel cuadrado de filtro de flujo rápido (B). A. Los espectros del papel cuadrado de filtro de flujo medio sin tratar fueron similares a los del papel cuadrado de filtro de flujo medio tratado con APS. El aumento de las inten...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Papel de filtro de celulosa, Grado 1 (papel de filtro de flujo medio)	GE Healthcare Pte Ltd Singapur	1001 110
Papel de filtro de celulosa, Grade113 (Papel de filtro de flujo rápido)	Sigma-Aldrich, Singapur	1113-320
3-aminopropiltrimetoxisilano	Sigma-Aldrich, Singapur	T1255	>96%
Glutaraldehído	Sigma-Aldrich, Singapur	G6257	Grado II, 25% en H2O
Álbum de suero bovino	Sigma-Aldrich, Singapur	A2153
Leche desnatada en polvo	Louis François		Empaquetado por Kitchen Capers, Singapur
Base Tris	Promega	H5135
Periodato de sodio	Merck	106597
Na2HPO4	Merck	106585
KH2PO4	Merck	104873
NaCl	CALBIOCHEM	567441
NaOH	Merck	106462
Hcl	Merck	100317
Tampón de fosfato salino (PBS)	N/A	N/A	El PBS, que contiene 137 mmol/L de NaCl, 2,7 mmol/L de KCl, 8,0 mmol/L de Na2HPO4 y 1,5 mmol/L de KH2PO4, se prepara con agua y se ajusta a un pH de 7,4 con 0,1 mol/L de NaOH o 0,1 mol/L de HCl
acetona	Tee Hai Chem Pte Ltd Singapur	9005-68
Mezcla de TMB y solución de peróxido de hidrógeno	Solución ultra TMB-ELISA de 1 paso, Thermo Scientific Pierce	34029	1 L
Anticuerpo de recubrimiento anti-IgG-Fc de cabra purificado por afinidad	Laboratorios Bethyl, Inc	A90-131A
Suero de referencia para ratones	Laboratorios Bethyl, Inc	RS10-101-5	9.5 mg/mL
HRP conjugado anti-ratón de cabra anticuerpo de detección IgG-Fc	Laboratorios Bethyl, Inc	A90-131P
equipo
Espectrofotómetro infrarrojo por transformada de Fourier	Shimadzu IR Prestige-21	N/A
horno	NUVE FN500	N/A
Mezclador turbo VM-2000	MYC LTD	N/A
Imagen J	RGB, descarga gratuita	N/A