1. Formación de biopelículas de C. tropicalis
- Prepare las biopelículas de Candida en una placa de microtitulación de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos, como se describió anteriormente (Figura 1).
- Agregue 100 μL de cultivo de C. tropicalis (de 10 a6 células/mL de caldo, preparado como se indicó anteriormente) a una placa de microtitulación de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal (Figura 2A). Mantenga las dos últimas columnas (11 y 12) como controles negativos 'sin hongos más suero' y 'sin hongos y sin suero' al no agregar células fúngicas. Llene las columnas 11 y 12 con 100 μL de ácido morfolinepropanosulfónico (MOPS) del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 solo.
- Cubra la placa de microtitulación con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C en condiciones estacionarias.
- Al día siguiente, aspire el medio con cuidado con una pipeta multicanal (sin tocar ni alterar las biopelículas). Golpee suavemente la placa en posición invertida sobre las hojas secantes para eliminar cualquier medio residual.
- Lave la placa con 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (por pocillo) utilizando una pipeta multicanal. Agregue PBS muy suavemente a lo largo de las paredes laterales del pocillo para evitar alterar las biopelículas. Aspire el PBS con cuidado con una pipeta multicanal. Repita el lavado PBS 2 veces (un total de tres lavados).
- Para eliminar el exceso de PBS, seque la placa al aire (sin la tapa) durante 30 minutos a temperatura ambiente, dentro de una cabina de seguridad biológica.
>2. Tratamiento del biofilm con anticuerpos
>NOTA: Las biopelículas ahora se pueden procesar para evaluar la inhibición de la maduración de la biopelícula por anticuerpos. Se utilizó suero murino como fuente de anticuerpos policlonales. Diferentes grupos de ratones inmunizados con Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis y Sap2-parapsilosis) junto con ratones inmunizados simuladamente se desangraron retroorbitalmente y se aisló el suero. La presencia de anticuerpos anti-Sap2 se confirmó mediante el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) específico de Sap2.
- Realizar la inactivación térmica del suero (fuente de anticuerpos policlonales) a 56 °C durante 30 min antes de su uso para descartar el papel del complemento en la actividad inhibitoria. Inactivar el suero con calor antes de diluir el suero.
nota: Utilice suero de ratones inmunizados simuladamente, ratones preinmunes y suero empobrecido con anticuerpos específicos de Sap2 como controles adicionales. El suero empobrecido en anticuerpos se preparó según un estudio previo. Entre las diluciones seriadas (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 y 1:12.800) para suero analizadas en este protocolo, se observó inhibición de la maduración de la biopelícula a 1:25, 1:50 y 1:100; Por lo tanto, se seleccionó 1:50 para lograr un equilibrio entre la inhibición y el consumo de suero.
- Prepare diluciones seriadas de muestras de suero inactivado por calor en medio estéril RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilice una dilución de suero común (1:50) para todas las muestras de suero que se vayan a analizar para determinar la inhibición de la maduración de la biopelícula.
- Añada 100 μL de la dilución de suero seleccionada a cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Para cada muestra, agregue diluciones de suero por duplicado, según el diseño adjunto (Figura 2B).
- En la columna 10, no agregue dilución de suero; agregue solo el medio RPMI 1640 MOPS para el control positivo solo por hongos.
nota: En la columna 10, filas G1-G8 y H1-H8 inicialmente había células fúngicas en RPMI-MOPS. Sin embargo, mientras que RPMI-MOPS se agregó a la columna 10 incluso después de 24 h, las filas G1-G8 sirvieron como control PBS y las filas H1-H8 como control sin suero después de 24 h.
- En la columna 11, agregue una dilución de suero 1:50 a todos los pocillos para que sirva como control negativo de no hongos más suero.
- En la columna 12, no agregue dilución de suero a ningún pocillo; manténgalo como el control sin hongos sin suero negativo.
- Cubra el plato con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C.
>3. Estimación de la actividad metabólica del biofilm
- Al día siguiente, aspire el suero cuidadosamente con una pipeta multicanal (sin tocar ni alterar las biopelículas). Golpee suavemente la placa en posición invertida sobre las hojas secantes para eliminar cualquier residuo de suero.
- Lave la placa con 200 μL de 1x PBS (por pocillo) utilizando una pipeta multicanal, añadiendo el PBS a lo largo de las paredes laterales del pocillo para evitar la interrupción de las biopelículas. Aspire el PBS con cuidado con una pipeta multicanal y repita el lavado del PBS 2 veces (un total de tres lavados). Seque la placa al aire (sin la tapa) durante 30 minutos a temperatura ambiente, dentro de una cabina de seguridad biológica para secar cualquier exceso de PBS.
- Preparación de XTT(2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxaniliuro)/menadiona:
- Prepare XTT en Ringers Lactato estéril como una solución de 0,5 g/L. Disuelva 25 mg de XTT en 50 mL de Ringers Lactato esterilizado con filtro. Alícuota 10 mL en tubos separados cubiertos con papel de aluminio y almacenar a -80 °C.
- Prepare la menadiona como un caldo de 10 mM. Disuelva 8,6 mg de menadiona en 5 ml de acetona y distribuya 50 μl en 100 microtubos separados. Almacene las alícuotas a -80 °C.
- Prepare la solución de XTT/menadiona justo antes de usarla tomando 10 mL de XTT y añadiendo 1 μL de menadiona para obtener una solución de trabajo de 1 μM.
- Añadir 100 μL de la solución XTT/menadiona por pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Cubra el plato con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 2 h a 37 °C en la oscuridad.
- Transfiera 80 μL del sobrenadante coloreado de cada pocillo a una placa nueva de 96 pocillos. Lea la placa a 490 nm.
- Calcule la media de los valores de absorbancia de los pocillos de la columna 10 (control positivo solo hongos), que servirá como valor de referencia para calcular el porcentaje de inhibición del biofilm por cada muestra de suero utilizando la ecuación (1).
% Inhibición de biofilm = 100 - 
× 100 (1)
