Un método basado en inmunofluorescencia para visualizar células de penacho en criosecciones de yeyuno

Abstract

Fuente: Mizutani, Y. et al., Uso de anticuerpos anti-fosfo-girdina para visualizar células de penacho intestinal en criosecciones de yeyuno de ratón que flotan libremente.J. Vis. Exp. (2018)

Este video ilustra un método basado en inmunofluorescencia para visualizar células de penacho intestinal en criosecciones de yeyuno de ratón que flotan libremente. Dentro de las vellosidades intestinales, la colocalización de fluorescencia verde en la punta luminal con una masa de raicillas rojas extendida indica la presencia de células de penacho.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparativos

1. Preparar 10 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS): 32,27 g de hidrogenofosfato de sodio (Na₂HPO₄·12H₂O), 4,5 g de dihidrogenofosfato de sodio (NaH₂PO₄·2H₂O), 80,0 g de cloruro de sodio (NaCl) añadidos al agua ultrapura hasta un volumen final de 10 L. Almacenar la solución a temperatura ambiente (RT).
2. Prepare 200 mL de PBS-T: 200 mL de PBS del paso 1.1 con 100 μL de éter de octilfenilo de polioxietileno (10) hasta una concentración final de 0.05% (vol: vol). Tienda en RT.
3. Mientras usa guantes y protección para los ojos, prepare 50 mL de sacarosa al 15% en una solución de formalina neutra tamponada al 10%: 7,5 g de sacarosa añadida a una solución de formalina neutra tamponada al 10% (Tabla de Materiales) hasta un volumen final de 50 mL. Tienda en RT.
   cautela: La inhalación y/o el contacto de la piel/los ojos con el formaldehído en una solución de formalina neutra tamponada al 10% puede ser peligrosa. Manéjelo con precaución.
4. Prepare 1,5 mL de 200 unidades/mL de solución madre conjugada de faloidina-colorante fluorescente: conjugado de faloidina-colorante fluorescente (300 unidades en 1 vial, sólidos liofilizados, longitudes de onda de excitación y emisión: 581 nm y 609 nm, respectivamente) suspendido en 1,5 mL de metanol. Almacene la solución en la oscuridad a -20 °C.
5. Prepare 5 mg/mL de solución madre de 4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato (DAPI): 10 mg de DAPI en 2 mL de N, N-dimetilformamida (DMF). Almacene la solución en la oscuridad a -20 °C.
6. Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en PBS: 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Conservar a 4 °C.
7. Retire la punta biselada de una aguja recta de calibre 18 con una pinza y apriete el extremo cortado con una pinza en dirección longitudinal para permitir que el líquido fluya a través de la luz de la aguja (Figura 1A1).
   nota: El protocolo se puede pausar aquí.

>2. Disección animal y aislamiento del yeyuno

1. Fijación por perfusión de un ratón
   1. Use guantes y trabaje en un área bien ventilada.
   2. Prepare un vaso de precipitados de vidrio de 100 mL, una solución de formalina neutra tamponada al 10%, herramientas quirúrgicas (tijeras, fórceps), una bandeja metálica, suturas cortadas de nylon 6-0, una aguja recta de calibre 18 preparada como en 1.7, una aguja alada de calibre 22, una jeringa de 20 mL.
   3. Cargue 20 ml de solución de formalina neutra tamponada al 10 % del vaso de precipitados de vidrio en la jeringa de 20 ml y conecte la aguja alada de calibre 22 a la salida.
   4. Prepare gelatina líquida añadiendo 1 g de gelatina en polvo a 20 ml de PBS (gelatina final al 5%) en un tubo de centrífuga de 50 ml. Después de remojar a RT durante 15 min, incubar a 50 °C en un baño de agua durante 15 min sin agitar.
   5. Agite brevemente e incube a 50 °C durante otros 15 minutos para disolver completamente la gelatina. Deje el tubo en RT hasta su uso.
   6. Sacrificar a un ratón adulto por dislocación cervical.
   7. Coloque el ratón del paso 2.1.6 en una bandeja metálica y haga una pequeña incisión en la piel a través del cartílago ensiforme con herramientas quirúrgicas.
   8. Expanda la incisión con ambas manos para exponer las regiones torácica y abdominal.
   9. Abra el peritoneo para exponer el diafragma y, a continuación, abra el diafragma por ambos lados.
   10. Corte la caja torácica a lo largo de las líneas axilares anteriores en ambos lados, luego retire la pared torácica cortando en dirección transversal en la posición del timo para exponer el corazón.
   11. Haga una pequeña incisión en la aurícula de la aurícula derecha para drenar la sangre e inserte una aguja alada de calibre 22 en el vértice del ventrículo izquierdo. Empuje el émbolo para perfundir los tejidos con una solución de formalina neutra tamponada al 10%.
   12. Después de exponer los órganos de la pelvis, corte el extremo del recto del ano y separe los intestinos del cuerpo cortando el mesenterio.
   13. Para aislar el yeyuno, corte los intestinos a 4 cm del lado anal del antro gástrico. Deseche la mitad anal del intestino delgado restante.
   14. Corta el yeyuno por la mitad para facilitar el procedimiento de lavado. Cargue 20 mL de solución de formalina neutra tamponada al 10% en la jeringa de 20 mL y conecte la aguja recta de calibre 18 preparada en el paso 1.7 a la salida.
   15. Inyecte una solución de formalina neutra tamponada al 10% desde un extremo del yeyuno recortado para eliminar el contenido intestinal y fijar la superficie del lumen intestinal (Figura 1A2).
   16. Lave el lumen intestinal inyectando PBS como se describe en el paso 2.1.15.
   17. Enjuague la gelatina líquida en el lumen intestinal como se describe en el paso 2.1.15 para reemplazar el PBS con gelatina líquida.
   18. Cierre un extremo del yeyuno recortado mediante ligadura de sutura con una sutura cortada de nailon 6-0, llene el yeyuno con gelatina líquida y cierre el extremo opuesto mediante ligadura de sutura (Figura 1A3).
   19. Agregue cuatro nudos de sutura para ajustar una sección de yeyuno en forma de salchicha a la porción deprimida de un criomold (Figura 1A4).
       nota: Para criomoldes con una sección deprimida de 20 mm x 25 mm x 5 mm, es preferible una sección de yeyuno similar a una salchicha de ~20 mm.
   20. Remojar los tejidos en 50 mL de sacarosa al 15% en una solución de formalina neutra tamponada al 10% durante la noche a 4 °C.
       nota: Estos pasos aseguran la crioprotección por sacarosa y la fijación de proteínas por formalina de gelatina y tejido. La gelatina gelatinizada con formalina no se funde a RT, mientras que la gelatina gelatinizada no fijada a 4 °C se funde a RT.

>3. Congelación instantánea de tejidos de yeyuno rellenos de gelatina

1. Al cortar el yeyuno en los nudos de sutura, se obtienen tres piezas de yeyuno en forma de salchicha con ambos extremos ligados (Figura 1A4). Alinee las piezas en forma de salchicha en un criomold para la adición de compuesto de inclusión para la preparación de muestras de tejido congelado.
2. Congele a presión el criomold en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Almacene los criomoldes a -80 °C
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

>4. Inmunofluorescencia de células de penacho mediante criosecciones de flotación libre

1. Crioseccionamiento
   1. Ajuste la temperatura de la cámara de criostato (CT) y la temperatura del objeto (OT) a -22 °C. Coloque el bloque de tejido congelado en un molde criogénico en la cámara de criostato durante al menos 15 minutos.
   2. Añadir 3 mL de PBS a una placa de cultivo de 35 mm.
   3. Retire el bloque de tejido congelado del criomold y corte el bloque por la mitad con una cuchilla de afeitar para exponer la sección transversal del yeyuno. Monte la mitad del bloque en un mandril (un adaptador de criostato) para seccionar el plano de corte con la hoja de afeitar.
   4. Corta el yeyuno relleno de gelatina en secciones de 30 μm de grosor. Utilice pinzas congeladas para transferir suavemente las secciones a la placa de cultivo de 35 mm preparada en el paso 4.1.2 (Figura 2B, derecha).
2. Aplicación de anticuerpos primarios
   1. Lave las secciones flotantes en el plato de cultivo de 35 mm 3 veces durante 5 min cada una con 3 mL de PBS-T agitando ligeramente en un agitador recíproco (aproximadamente 36 veces/min).
   2. Preparación de la solución de recuperación de antígenos: 0,3 mL de concentrado de solución de recuperación de antígenos (Tabla de Materiales) en 2,7 mL de agua ultrapura. Añada 3 mL de solución de recuperación de antígeno a la placa de cultivo de 35 mm que contiene secciones flotantes.
   3. Cierre la tapa, selle el espacio entre el plato y la tapa con una tira de cinta vinílica e incube a 50 °C en una incubadora de hibridación durante 3 h sin agitar.
   4. Retire el plato de la incubadora y enfríe a temperatura media durante 20 minutos. Después de retirar la cinta de vinilo, lave las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una con 3 ml de PBS-T y agite suavemente.
   5. Aspirar el PBS-T y añadir 5 gotas de solución de bloqueo (Tabla de Materiales) sobre las secciones. Incubar en RT durante 5 min con una leve agitación.
   6. Preparar la solución de anticuerpos primarios: 495 μL de BSA al 5% en PBS con 5 μL de anticuerpos fosfo-Y1798 girdina (pY1798) (Tabla de Materiales). Añada 500 μL de solución de anticuerpo primario a las secciones (no es necesario retirar la solución de bloqueo).
   7. Coloque la placa en una cámara de incubación humidificada e incube durante la noche a 4 °C con una agitación suave.
      nota: La incubación nocturna puede extenderse hasta tres noches.
3. Aplicación de anticuerpos secundarios
   1. Lave las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una con 3 mL de PBS-T agitando suavemente.
   2. Preparación de la solución madre diluida de DAPI: 2 μL de solución madre de DAPI (Paso 1.5), 998 μL de PBS.
   3. Preparar solución de anticuerpo secundario: 476 μL de BSA al 5% en PBS, 10,5 μL de solución diluida de DAPI, 12,5 μL de solución madre conjugada de faloidina-colorante fluorescente, 1 μL de conjugado de colorante fluorescente IgG anti-conejo de cabra (longitud de onda: excitación 496 nm, emisión 520 nm).
   4. Después de aspirar el PBS-T, aplique la solución de anticuerpos secundarios e incube en una cámara de incubación protegida por luz a RT durante 30 minutos con una agitación leve.
   5. Lave las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una con 3 mL de PBS-T y agitando suavemente.
   6. Después del lavado final, retire el PBS-T y reemplácelo con 3 mL de PBS que carezca de éter de polioxietileno (10) octilfenilo. Transfiera el plato a un microscopio estereoscópico.
   7. Coloque 200 μL de PBS en una gota en el centro de un portaobjetos de vidrio blanco recubierto de MAS y transfiera una sección de yeyuno de la placa a la gota con una punta de pipeta P200.
   8. Después de ajustar la alineación de la sección bajo el microscopio estereoscópico, aspire todo el PBS restante que rodea la sección.
   9. Añada 20 μL de medio de montaje acuoso y coloque un cubreobjetos de 20 x 20 mm encima del soporte.
   10. Selle inmediatamente los bordes de la cubierta con medios de montaje a base de xileno. Coloque la corredera en un mappe de madera y deje que los medios de montaje a base de xileno se solidifiquen en RT durante 2 a 3 h.
       nota: El protocolo se puede pausar aquí. Después de que los medios de montaje a base de xileno se solidifiquen, los portaobjetos se pueden almacenar durante 2 a 3 semanas en una caja de portaobjetos con protección contra la luz en RT.

>5. Microscopía confocal

1. Coloque aceite de inmersión en el objetivo 63X de un microscopio confocal. Gire la corredera hacia abajo y colóquela en el escenario.
2. Digitalice las imágenes TC adquiridas en las longitudes de onda láser 405, 488 y 555 nm y guarde las imágenes en formato tiff (.tiff).
   nota: Elija un conjunto de filtros de detección que sea apropiado para los tintes de fluorescencia (es decir, máximos de excitación/emisión: 358/461 nm, 490/525 y 590/617).

Results

Figura 1: Relleno en gelatina de secciones de yeyuno para la preservación morfológica de criosecciones
(A) Fotografías de los procedimientos para el llenado intraluminal del yeyuno de ratón con gelatina. (A1) Se retiró la punta biselada de una aguja recta de calibre 18 para evitar perforar la pared intestinal. (A2) Se inyectó una solución de for...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slc:Ratones hembra DDY de 6 semanas de edad	Chubu Kagaku Shizai	No aplicable
Hidrógeno disódicofosfato 12-agua (Na2HPO412H2O)	Wako	196-02835
Dihidroenfosfato de sodio dihidratado (NaH2PO42H2O	Wako	199-02825
Cloruro de sodio (NaCl)	Wako	199-10665
Triton X-100, éter de polioxietileno (10) octilfenilo	Katayama Químico	No aplicable
sacarosa	Wako	190-00013
Solución de formalina neutra tamponada al 10%	Muto Químico	20215	Paso 1.3.
Conjugado de faloidina y colorante fluorescente, Alexa Fluor 594 faloidina	ThermoFisher Scientific	A12381
metanol	Nacalai Tesque	21915-35
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)	ThermoFisher Scientific	D1306
N.N-dimetilformamida (DMF)	Nacalai Tesque	13015-75
Albúmina sérica bovina	sigma	A9647-10G
Aguja recta de acero inoxidable de calibre 18	Terumo	NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm sutura de nylon, Crownjun	Kono Seisakusho	No aplicable
Aguja alada de calibre 22	Terumo	SV-22DLK
Jeringa TERUMO de 20 mL	Terumo	SS-20ES
Tubo de centrífuga de 50 mL	TPP	91050
Tubos de centrífuga Iwaki de 15 mL	Iwaki	2325-015
Microtubo de ensayo de 1,5 mL	estrella	RSV-MTT1.5
Gelatina en polvo, Gelare-blanc	Biolaboratorio de Nitta	Artículo 2809
Compuesto de inclusión para muestra de tejido congelado, Compuesto O.C.T. 118 mL 12 piezas	Sakura FineTech	4583
Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piezas, tamaño pocillo 20 x 25 x 5 (mm)	Shoei Work's	Artículo 1101-3
Isopentano	Nacalai Tesque	26404-75
Plato de cultivo celular Falcon 35 x 10mm Easy-Grip	Corning	353001
Solución de recuperación de antígenos concentrada, solución de recuperación de objetivos pH 9 10x	Dako	S2367	Concentrado de solución de recuperación de antígenos en el paso 4.2.2.
Bloque de proteínas	Dako	X0909	Solución de bloqueo en 4.2.5.
Anticuerpos contra Phospho-Y1798 girdina (pY1798)	Laboratorios Inmunobiológicos (IBL) = Empresa X	28143	Anticuerpos contra Phospho-Y1798 girdin en el paso 4.2.6.
Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) de cabra con alta adsorción cruzada, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11034
Medios de montaje Aqous, Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Cubreobjetos, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 piezas Espesor No.1	Vidrio Matsunami	C022221
Entellan Nuevo medio de montaje a base de xileno para microscopía	Merck Millipore	107961
Vidrio deslizante con recubrimiento MAS blanco	Vidrio Matsunami	MI-MAS-01
Mapeo de madera tipo KO	Shoei Work's	99-40007
Aceite de Inmersión 518 F Sin Fluorescencia 20 ml	Zeiss	444960
Pipetas, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601 F123602
Sistema de producción de agua ultrapura	Advantec	GS-590
Guante de plástico, Guante de nitrilo estrella	estrella	RSU-NGVM
Criostato	Microsistemas Leica	CM1950
Congelador profundo, SANYO Ultra Bajo	Sanyo	MDF-382
Nevera de vitrina	Congelador Nihon	NC-ME50EC
Baño de agua, Thermominder SDminiN (para disolver gelatina a 50 C)	Taitec	0068750-000
Incubadora de hibridación (para recuperación de antígenos a 50 C)	Taitec	HB-100
Cámara de incubación para inmunotinción	Cosmo Bio	10HACER
Agitador recíproco para inmunohistoquímica (a temperatura ambiente)	Taitec	NR-1
Agitador recíproco para inmunohistoquímica (para 4 C)	Tokio Rika Kikai	MMS-3010
Microscopio estereoscópico (para la manipulación de tejidos)	Olimpo	SZ61
Microscopio estereoscópico (para la Figura 1B)	Microsistemas Leica	M165FC
Microscopio de fluorescencia (para la Figura 3)	Nikon	E800
Microscopio de barrido láser confocal	Zeiss	LSM700