Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Transfección de células 293T con luciferasa y recolección de sobrenadante viral
- Cultivo de células 293T
- Prepare los medios agregando lo siguiente a un litro de medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco cada uno: 110 mL de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 11 mL de penicilina-estreptomicina.
- Descongele 5 celdas x 106 293T y transfiéralas a un matraz T175 con los medios preparados como se describe anteriormente.
- Divida las celdas 293T 1:10 cada 3 días durante 6 días. No permita que las células confluyan más del 90%.
- Transfección de células 293T
nota: Se calculan las siguientes cantidades de reactivos para la transfectación de un matraz T175 de células 293T. Ajuste en consecuencia si se van a transducir más frascos.
- Transfiera 1,5 mL de medio a cada uno de los dos tubos de 50 mL con una pipeta. A un tubo, agregue 10 μg de plásmido VSV-G, 20 μg de Gag/pol y 20 μg de plásmido luciferasa de tomate rojo escarabajo (CBR-TDR) y mezcle. Al otro tubo, agregue 100 μL de reactivo de transfección de ADN in vitro y mezcle. Incubar ambos tubos a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
nota: Todos los plásmidos descritos en este manuscrito fueron proporcionados por el Dr. Vladimir Ponomarev.
- Transfiera el medio que contiene el reactivo de transfección in vitro de ADN gota a gota al tubo que contiene los plásmidos de ADN (durante aproximadamente 30 s) y mezcle suavemente con una pipeta. Incubar en RT durante 20 min.
- Durante esta incubación de 20 minutos, separe las células 293T añadiendo 5-10 mL de tripsina al 0,05%. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 10 mL de medio y centrifugue a 800 x g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en 1,5 mL de medio.
- Añadir el medio que contiene el reactivo de transfección in vitro de ADN y los plásmidos de ADN a las células 293T e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Transfiera a un matraz T175 y agregue 18 mL de medio. Incubar a 37 °C durante la noche.
- Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio sin desprender las células. Reemplace con 18 mL de medio nuevo. Incubar a 37 °C durante la noche en una incubadora.
- Recolección de sobrenadante viral
- Retire el sobrenadante viral con una pipeta puesta en hielo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min para pellet las células y los residuos.
nota: Si la célula es grande, es probable que las células se hayan desprendido del matraz cuando se retiró el sobrenadante. Estas células se pueden volver a sembrar en un matraz nuevo con medios frescos.
- Filtre el sobrenadante viral con un filtro de 0,22 μm.
- Use el sobrenadante viral inmediatamente. Manténgalo en hielo o a 4 °C durante un máximo de 24 horas, o congélelo a -80 °C para almacenarlo a largo plazo.
>2. Expansión y transducción de células T humanas activadas con luciferasa
- Activación de linfocitos T humanos in vitro
- Lave las perlas añadiendo 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a un tubo estéril de 15 mL, añadiendo perlas (una perla por cada dos células T), colóquelas en una rejilla magnética durante 2 minutos y aspire el PBS.
- Prepare el medio como se describe en el paso 1.1.1, luego agregue IL-2 hasta una concentración final de 30 UI/mL y agregue las perlas lavadas. Produzca 2,5 ml de medio por cada dos millones de células T que se activen.
- Cuente las células T (recién purificadas o previamente purificadas, congeladas, descongeladas y lavadas) con un hemocitómetro y tinción de azul de tripán. Añada las células T al medio preparado en el paso 2.1.2 e invierta suavemente el tubo para mezclar. Las células T se expandirán al menos 20 veces dependiendo de la fuente y la salud general de las células. Determine el número de células T que se activarán calculando el número necesario para tratar a los ratones y dividiéndolo por 20. Aquí, se utilizaron 20 x 106 células T por ratón según experimentos preliminares.
- Placa de 2,5 mL de medio que contiene dos millones de células T, perlas e IL-2 (interleucina 2) en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
- Examine las células T bajo un microscopio de 20 aumentos todos los días durante los próximos 3 días para determinar cuándo transducir con luciferasa. Las celdas están listas cuando se agrupan y agotan el medio, convirtiéndolo de rojo/rosa a naranja claro.
- Preparación de placas de retronectina
nota: La retronectina se utiliza para recubrir las placas utilizadas en la transducción, ya que mejora la transducción de genes.
- Agregue 2 mL de 20 μg/mL de retronectina en PBS a un pocillo de una placa de 6 pocillos sin tratar. Incubar durante 2 h a RT o 1 h a 37 °C. Se requiere un pocillo recubierto de retronectina por cada dos millones de células T que se van a transducir.
- Aspire la retronectina sin rascar el fondo de la placa.
- Agregue 3 mL de BSA al 2% en PBS (filtrado estéril) por pocillo en la placa de 6 pocillos. Incubar durante 30 min en RT.
- Espinoculación
- Aspire el BSA sin rascar la parte inferior de la placa.
- Lave los pocillos una vez con 3 mL de PBS por pocillo. Continúe o reemplace con PBS nuevo y deje la placa tapada a 4 °C durante la noche.
- Añadir 2 mL de sobrenadante viral de luciferasa CBR-TDR (recogido en el paso 1.3) por pocillo.
- Centrifugar a 1.240 x g durante 90 min a 32 °C.
- transducción
- Cuenta las células T.
- Aspire el sobrenadante viral sin rascar el fondo de la placa.
- Coloque dos millones de células T por pocillo en 6 mL de DMEM que contengan 30 UI/mL de IL-2 humana.
- Examine las células T a diario. Las células T están listas para expandirse cuando están casi confluentes, generalmente después de 2 días.
- Cuando las células estén casi confluentes, lávelas suavemente del fondo de la placa con una pipeta y transfiera cada pocillo a un matraz T75 separado. Agregue 9 mL de medio para un total de 15 mL de medio por matraz.
- Al día siguiente, agregue 15 ml adicionales de medio. Las células deben estar listas para inyectarse en ratones al día siguiente de esta adición de medios. Confirme el éxito de la transducción mediante la realización de citometría de flujo (la construcción de luciferasa contiene un fluoróforo de tomate TD que es visible en el canal de PE).
>3. Injerto de células T transducidas con luciferasa en ratones inmunocomprometidos
- Prepare y cuente las células T para la inyección.
- Retire las células T de los matraces y cuente. Las células están listas para inyectarse cuando se han expandido 20x-30x, generalmente el día 7 después de la activación.
- Centrifugar las células T a 800 x g durante 5 min. Vuelva a suspender en 2 mL de medio y retire las perlas con una rejilla magnética.
- En el caso de los experimentos en los que las células T se inyectarán por separado de los anticuerpos biespecíficos, se contarán las células T y se volverá a suspender para que la concentración final sea de 20 millones de células T por 100 μl de medio. Vaya al paso 3.2. En el caso de los experimentos en los que se utilizan células T armadas ex vivo (EAT), vaya al paso 3.1.4.
- En el caso de los experimentos con células T armadas ex vivo, se cuentan las células T y se separan en tubos individuales de 1,5 ml para cada grupo, con 20 millones de células por ratón. Por ejemplo, si hay tres grupos de cinco ratones cada uno, prepare tres tubos de 1,5 ml con 100 millones de células T cada uno.
- Centrifugar los tubos de 1,5 ml a 800 x g durante 5 min. Retire el medio con cuidado sin alterar el gránulo de células T. Vuelva a suspender en no más de 50 μL de medio que contenga los anticuerpos biespecíficos. Incubar en RT durante 30 min.
nota: A los efectos de los experimentos realizados en este estudio, se utilizaron anticuerpos biespecíficos patentados IgG-[L]-scFv que se unen a las células T generados en el laboratorio. Para el armado de células T, use 5 μg de anticuerpo por cada 20 x 106 células T. También se podrían utilizar anticuerpos biespecíficos disponibles en el mercado.
- Lave el exceso de anticuerpos añadiendo 1.450 μL de medio a cada tubo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min, aspirar cuidadosamente el medio y volver a suspender a una concentración de 20 millones de células T armadas por cada 100 μL de medio.
- Inyección e injerto en ratones
- Anestesiar a los ratones en una cámara que suministra isoflurano inhalado al 3,5% (v/v) en oxígeno de 1 L/min. Los ratones están completamente anestesiados cuando el reflejo de retirada del pedal de la extremidad trasera ha desaparecido.
NOTA: Proporcionar soporte térmico durante todo el procedimiento.
- Con una aguja de 26 G, inyecte 20 millones de células T en 100 μL de medio retroorbitalmente por ratón.
- Administrar 1.000 U de IL-2 recombinante por vía subcutánea para apoyar la supervivencia de las células T in vivo.
- Administrar los anticuerpos biespecíficos por vía retroorbital (en el ojo, no se utiliza para la inyección de células T) o intraperitoneal. Permita que los ratones se recuperen de la anestesia y regresen a sus jaulas><.
NOTA: Una vez más, en este caso, se utilizaron anticuerpos patentados que se generaron en el laboratorio, pero en su lugar se podrían utilizar anticuerpos disponibles en el mercado. En los experimentos aquí, se administraron 0,3-10 μg de anticuerpo por ratón por dosis. Los anticuerpos se administraron dos veces por semana durante 3-4 semanas.
>4. Imágenes in vivo de ratones injertados con células T transducidas por luciferasa
NOTA: Este paso debe realizarse el día de la toma de imágenes, que no es necesariamente el mismo día en que se administran las células T y/o los anticuerpos a los ratones. Por lo general, realizamos imágenes 24 horas después de la administración de las células T transducidas con luciferasa.
- Preparación de D-luciferina
- Disolver 1 g de D-luciferina en 33,3 mL de PBS estéril (concentración final: 30 mg/mL).
- Alicuente la D-luciferina disuelta en 33 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y mantenga los tubos a -20 °C.
- El día de la toma de imágenes, descongele suficientes alícuotas de 30 mg/mL de D-luciferina para el número de animales que se van a fotografiar. Un tubo es suficiente para 10 animales.
NOTA: Vuelva a congelar la D-luciferina restante después de su uso. La D-luciferina es estable durante al menos cinco ciclos de congelación/descongelación.
- Administración de D-luciferina a ratones
nota: Antes de administrar D-luciferina a los ratones, abra el software de imágenes e inicialice el sistema. La cámara puede tardar varios minutos en enfriarse, y esto debe hacerse antes de que los ratones se inyecten con D-luciferina para garantizar que las imágenes puedan tener lugar 5 minutos después de la administración del sustrato.
- Anestesiar hasta cinco ratones en una cámara que suministra isoflurano inhalado al 3,5% (v/v) en oxígeno de 1 L/min. Los ratones están completamente anestesiados cuando el reflejo de retirada del pedal de la extremidad trasera ha desaparecido.
- Una vez que los ratones estén completamente anestesiados, administrar 100 μL de 30 mg/mL de D-luciferina por ratón (3 mg por ratón) mediante inyección retroorbital con una aguja de 26 G. Imagínese a este grupo de ratones antes de administrar D-luciferina al siguiente grupo. Coloque el siguiente grupo de ratones en la cámara de isoflurano para ser anestesiados mientras se toman imágenes del grupo anterior.
- Obtención de imágenes de células T transducidas con luciferasa
- Mueva los ratones anestesiados a la cámara hermética a la luz del generador de imágenes y continúe administrando isoflurano al 3% a 0,5 L/min. Coloque los ratones de lado de modo que el flanco que lleva el xenoinjerto quede hacia la cámara. Tome otra serie de imágenes con los ratones en posición supina para evaluar la presencia de células T en los pulmones.
- En el Panel de control de adquisición, seleccione Luminiscente, Fotografía y Superposición. Establezca el tiempo de exposición en automático, el agrupamiento en medio y F/Stop en 1. Adquirir imágenes. Después de la primera imagen, ajuste el tiempo de exposición para que coincida con el que se calculó automáticamente para la primera imagen, de modo que las imágenes posteriores se puedan comparar directamente. Puede ser útil capturar imágenes con múltiples tiempos de exposición para determinar el tiempo de exposición óptimo para lograr la señal más brillante sin saturación de píxeles.
- Retire a los ratones del isoflurano, devuélvalos a sus jaulas y observe hasta que estén despiertos y ambulatorios.
- Repita los pasos del paso 4.2.1 hasta que se haya creado una imagen de todos los grupos.
