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1. Cultivos de células y parásitos
- Cultive células LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) de la American Type Culture Collection (CCL-7) en un matraz de cultivo celular de 25cm2 que contiene en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con un 10% de FBS (suero fetal bovino) inactivado por calor y antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C en dióxido de carbono (CO2) al 5%.
- Infectar células LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi (cepa Y) de acuerdo con un protocolo previo.
- Recoja el sobrenadante de las células infectadas LLC-MK2 (5 mL) en un tubo de centrífuga cónica de cultivo celular de 15 mL y centrifugue a 500 x g durante 10 minutos y 22 °C para reducir los restos celulares. Mantenga el tubo durante 10 minutos a 37 °C para permitir que los tripomastigotes naden hacia el sobrenadante.
- Recoja el sobrenadante en un tubo cónico nuevo y centrifugue a 2500 x g durante 15 minutos a 22 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet que contiene los parásitos en un medio RPMI completo para determinar la densidad celular mediante el recuento de células en una cámara Neubauer.
>2. Protocolo de inmunofluorescencia de control
NOTA: Una vez fijas, es posible almacenar placas que contienen cubreobjetos a 4 °C en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (pH 7,2) durante una semana. Para ser almacenadas, es importante que las células no hayan pasado por la etapa de permeabilización.
- Fije las celdas LLC-MK2 (2 x 10,4) en placas de 24 pocillos que contienen cubreobjetos redondeados esterilizados con ultravioleta (UV) en medios RPMI durante 16 horas.
- Para las células infectadas, añadir un sobrenadante que contenga T. cruzi (ítem 1.4) a cada pocillo en proporción (multiplicidad de infección, MOI 10:1) y dejar actuar durante 6 h de infección. Lave los cubreobjetos que contienen células infectadas y no infectadas cinco veces con solución de PBS y se fije con paraformaldehído al 2% en 1x PBS (pH 7,2) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con 1x PBS (pH 7.2).
- Permeabilizar los cubreobjetos con IGEPAL CA-630 al 0,2% (octilfenoxipolietoxietanol) en 1x PBS (PH 7,2) durante 10 min en RT.
- Lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con 1x PBS.
- Incubar los cubreobjetos durante 30 min en RT con la solución de bloqueo (2% de albúmina sérica bovina, BSA en 1x PBS, pH 7,2).
- Incubar cubreobjetos durante 30 min en RT con anticuerpos monoclonales de ratón anti-hnRNPA1 (anti-heterogéneo ribonucleoproteína-A1) (dilución 1:200) o con anticuerpos policlonales de ratón anti-TcFAZ (anti-Trypanosoma cruzi flagelo zone protein) (dilución 1:100) diluidos en solución de bloqueo.
- Lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con 1x PBS.
- Incubar los cubreobjetos durante 30 min en RT con IgG F (ab')2 (H+L) anti-ratón de cabra conjugada con Alexa Fluor 488 (1:600) junto con faloidina conjugada con Alexa 594 (1:300) para teñir filamentos de actina (F-actina) en la célula huésped diluida en la solución de bloqueo.
- Lavar tres veces con 1x PBS (pH 7.2) durante 5 minutos cada una.
- Aplique una pequeña cantidad de reactivo de montaje antidecoloración ProLong Gold con medio 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) sobre la superficie del portaobjetos.
- Con unas pinzas, incline suavemente el cubreobjetos en el medio de montaje para evitar que se formen burbujas. Una vez seco, selle el cubreobjetos si lo desea.
>3. Protocolo de inmunofluorescencia de doble marcaje utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales generados en el mismo huésped
- Repita los pasos 2.1 a 2.6 descritos anteriormente.
- Incubar cubreobjetos que contengan células infectadas y no infectadas con anticuerpo policlonal anti-TcFAZ de ratón interno (1:100) diluido en solución bloqueante durante 30 min a RT.
- Lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con 1x PBS.
- Incubar cubreobjetos durante 30 min en RT con IgG anti-ratón de cabra F (ab')2 (H+L) conjugado con Alexa Fluor 647 (1:600) diluido en la solución de bloqueo.
- Lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con 1x PBS.
- Realizar el segundo paso de bloqueo con IgG (H+L) anti-ratón de conejo AffiniPure diluida (0,12 mg/mL) en solución bloqueante durante 30 min a RT.
- Lave los cubreobjetos tres veces con 1x PBS (pH 7,2) durante 5 minutos cada uno. A continuación, incubar con el anticuerpo monoclonal anti-hnRNP A1 IgG2b de ratón (1:200) durante 30 min en RT.
- Lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con 1x PBS.
- Incubar los cubreobjetos durante 30 min con el anticuerpo IgG2b anti-ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (1:600) y con faloidina conjugada con Alexa 594 (1:300) diluida en la solución de bloqueo.
- Lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con 1x PBS.
- Repita los pasos 2.8 a 2.10 descritos anteriormente.