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1. Purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad utilizando un sistema automatizado de cromatografía rápida de proteínas y líquidos (FPLC)
NOTA: El siguiente procedimiento se puede aplicar generalmente a la mayoría de los sistemas automatizados. La purificación se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 °C (si el sistema FPLC se mantiene en una habitación fresca). Se puede realizar una serie de pruebas de exploración para identificar las condiciones óptimas de purificación, incluida la matriz de columna adecuada, el tampón de unión, el tampón de elución y el pH para garantizar la máxima recuperación del anticuerpo purificado de los medios acondicionados (consulte la sección Resultados). Las condiciones óptimas dependen del anticuerpo o proteína que se purifique. Las purificaciones se realizaron en un sistema FPLC automatizado. Las purificaciones se realizaron a temperatura ambiente utilizando una columna de 5 ml de proteína A.
- Prepare los siguientes tampones con agua ultrapura y ajústelos al pH recomendado, luego filtre a través de un filtro de 0,22 μm.
- Prepare 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 (tampón aglutinante) mezclando lo siguiente: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4 y 0,001 M KH2PO4. Ajuste el pH si es necesario antes de filtrar el tampón.
- Preparar 500 ml de glicina-HCl 0,1 M pH 2,7 (tampón de elución). Ajuste el pH antes de filtrar el tampón.
- Preparar 50 ml de 1 M Tris pH 9.0 (tampón de neutralización).
- Asegúrese de que se hayan realizado todas las conexiones de alimentación y comunicación del sistema con la computadora. Los dispositivos deben estar visibles en el módulo de software 'Control del sistema'. Asegúrese de que la celda UV esté configurada en una longitud de onda de 280 nm. Opcional: Calibrar el medidor de pH si está conectado y se va a utilizar.
- Sumerja los tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura para lavar el sistema. Purgue las bombas con una jeringa si hay aire en el tubo o si se sospecha que hay aire en el sistema. Lave el sistema con agua mediante operación manual a través del controlador del sistema o mediante un método automatizado. Observe que la presión, la conductividad, el trazado UV280 y el pH permanezcan consistentes y que el límite de presión para la columna no se exceda según las especificaciones del fabricante><.
nota: Las anomalías pueden indicar aire o bloqueo en el sistema que deben abordarse antes de continuar.
- En el módulo controlador del sistema, inicie el caudal a 1 ml/min manualmente a través de la bomba A en la posición de carga (bucle de derivación de muestra) o inyección (a través del bucle de muestra) para comenzar a conectar la columna. Desconecte la tubería del sistema en la entrada de la posición de la columna y retire el tapón conectado a la entrada de la columna.
- Permita que el agua fluya desde la tubería del sistema gota a gota en la parte superior de la columna, luego conecte la tubería del sistema a la columna. Tener la entrada de la columna y el accesorio de entrada rebosantes de gotas de agua asegura una conexión libre de burbujas de aire.
- Conecte la salida de la columna en la salida aguas abajo y verifique que todos los accesorios estén bien sujetos. Con la columna ahora conectada al sistema, no exceda los límites para el límite de presión máxima y el caudal como se describe en las especificaciones de la columna.
- Columna de lavado con 5 volúmenes de columna (CV) de agua. Si es necesario, continúe el lavado en columna hasta que el trazado UV280 se haya estabilizado.
- Sumerja los tubos de entrada de A en el tampón de unión, B en el tampón de elución y la bomba de muestra en el tampón de unión para equilibrar el sistema en los tampones correctos. Llene los tubos de entrada con tampón usando PumpWash mediante operación manual.
- En el módulo 'Editor de métodos' del software, utilice el asistente de métodos para configurar un método de cromatografía de afinidad para la columna que se va a utilizar.
nota: Los sistemas FPLC automatizados vienen con métodos precargados con los ajustes recomendados (es decir, caudal y límite de presión) y pasos de ejecución basados en la columna (fabricante, matriz y tamaño) seleccionada para la purificación.
- Utilice los siguientes pasos de ejecución para la cromatografía de afinidad de proteína A:
- Equilibre el sistema con 5 CV de tampón de unión y recoja el flujo hacia el contenedor de residuos.
- Cargue la muestra en la columna (el volumen que se va a cargar se especifica manualmente en el método) y recoja el flujo en un contenedor separado.
- Lave el sistema con 5 CV de tampón de encuadernación y recoja el flujo en un recipiente separado.
- Columna de elución con fraccionamiento isocrático de 5 CV utilizando tampón de elución y recoja la muestra de anticuerpos purificada como colector de fracciones por fracciones.
- Equilibre el sistema con 5 CV de tampón de unión y recoja el flujo hacia el contenedor de residuos.
- Una vez que se haya configurado el método, especifique el volumen de medios condicionados que se aplicarán a la columna y guarde el método.
nota: El volumen especificado en el método debe ser de 5 a 10 ml menor que el volumen real para evitar la introducción de aire durante la toma de muestra. El volumen especificado utilizado en este protocolo es de 90-120 ml.
- Sumerja el tubo de la bomba de muestra en el recipiente que contiene el medio acondicionado.
- Prepare un recipiente separado para recoger el flujo de muestras a través del tubo de salida especificado.
nota: Es importante recoger el flujo en caso de que se produzca un error durante la ejecución o se exceda la capacidad de unión de la columna, lo que requiere que el flujo se vuelva a aplicar a la columna o se repita la purificación.
- Prepare los tubos de recolección en el colector de fracciones. Añadir 100 μl de tampón de neutralización por volumen de fracción de 1 ml. El sistema FPLC eluirá automáticamente las fracciones en los tubos de recolección.
- En el módulo 'Control del sistema' del software, abra el método a ejecutar.
nota: La ejecución del método se inicia en una serie de páginas que incluyen la comprobación de las variables del método, la configuración del recopilador de fracciones y la definición del nombre del archivo de resultados y la ubicación de almacenamiento.
- Haga clic en INICIAR para iniciar la ejecución. La ejecución se puede supervisar en el módulo 'Control del sistema'.
- Al finalizar el ciclo de purificación, compruebe el cromatograma resultante en el módulo "Evaluación" del software del sistema.
- Combine todas las fracciones que contienen proteínas en un tubo separado, intercambie tampones y concéntrelo en PBS utilizando un dispositivo de filtro centrífugo con un corte de peso molecular de 30 kDa. Realice los pasos de centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Mida la concentración de anticuerpos mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Si se va a realizar otra ejecución de purificación, cebe el tubo de la bomba de muestra en el tampón de unión y repita los pasos 1.9-1.14.
- Al finalizar los ciclos de purificación, sumerja los tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura y lave el sistema y la columna como se realizó en el paso 3.
- Sumerja los tubos A, B y de la bomba de muestra en etanol al 20% y repita el procedimiento de lavado para el almacenamiento del sistema y la columna.
- Desconecte la columna de la salida aguas abajo y reemplace el tapón de columna, luego desconecte la columna en la entrada y reemplace el tapón, vuelva a conectar la tubería al sistema. Almacene la columna a 4 °C.